《Immunobiology》：Exploring the mechanism underlying negative pressure wound therapy in promoting the healing of diabetic foot ulcers via integrated multi-omics and bioinformatics approaches
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背景：糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病最严重的并发症之一，与高截肢率、死亡率和医疗负担密切相关，临床治疗研究仍有限。负压创面疗法（NPWT）是一种针对DFU的治疗方式，但其促进伤口愈合的具体机制仍不清楚。方法：本研究使用的DFU bulk RNA-seq和scR
背景：糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病最严重的并发症之一，与高截肢率、死亡率和医疗负担密切相关，临床治疗研究仍有限。负压创面疗法（NPWT）是一种针对DFU的治疗方式，但其促进伤口愈合的具体机制仍不清楚。方法：本研究使用的DFU bulk RNA-seq和scRNA-seq数据来自GEO数据库。首先，研究通过差异分析和多种机器学习算法识别NPWT激活的关键基因。随后，研究人员使用GSVA和AddModuleScore分析评估角质形成细胞（KCs）的间充质-上皮转化（MET）能力，并利用CytoTRACE和伪时间轨迹分析构建MET分化轨迹。最后，通过免疫荧光（IF）验证DFU临床样本中GRHL2的表达。结果：差异表达分析鉴定出DFU中975个失调基因（530个上调，445个下调）。通过四种机器学习算法，GRHL2被一致筛选出来。在RNA和蛋白水平上，GRHL2主要在皮肤中表达。对13个DFU样本的单细胞分析证实GRHL2主要在KCs中表达。具体而言，NPWT激活GRHL2，从而驱动间充质成纤维细胞（MFs）转化为棘上角质形成细胞（supraspinous_KCs）。此外，分子对接提示小白菊内酯（Parthenolide）、MG-132、米托蒽醌（Mitoxantrone）和伊立替康（Irinotecan）可能对治疗DFU具有潜在疗效。最后，IF结果显示GRHL2表达与转录组分析结果一致。结论：总体而言，本研究建立了DFU修复中“MFs - supraspinous_KCs”的MET模型。此外，本研究提出的“NPWT - GRHL2 - MET - 细胞转化”信号轴补充了NPWT通过调控细胞命运决定促进伤口愈合的分子机制，将物理刺激的生物效应从宏观组织修复表型深化到微观细胞转化水平，进一步丰富了NPWT促进伤口愈合的机制。
**论文解读：整合多组学与生物信息学揭示负压创面疗法促进糖尿病足溃疡愈合的机制**
**研究背景与问题**
糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病最严重的并发症之一，与高截肢率、死亡率和医疗负担密切相关。传统治疗方法如清创、抗感染、减压和血运重建的临床疗效有限。负压创面疗法（NPWT）已被证实可显著缩短DFU愈合周期、降低截肢风险，但其促进伤口愈合的分子机制，特别是机械应力如何转化为细胞信号并调控细胞命运决定（如间充质-上皮转化，MET）仍不清楚。这一机制空白限制了NPWT治疗潜力的进一步挖掘和个体化方案的优化。因此，研究人员开展本研究，旨在通过整合多组学与生物信息学方法，鉴定NPWT激活的关键转录效应因子，阐明其细胞类型特异性表达及功能，并探索低成本药物替代方案。
**研究内容与结论**
研究人员整合了来自GEO数据库的bulk RNA-seq和scRNA-seq数据，结合多种机器学习算法（SVM-RFE、LASSO、随机森林、XGBoost），系统分析了NPWT处理前后DFU患者的基因表达变化。通过差异分析和机器学习的交叉验证，筛选出GRHL2作为NPWT激活的关键效应因子。单细胞RNA测序分析显示GRHL2主要在角质形成细胞（KCs）中表达，且与棘上角质形成细胞（supraspinous_KCs）的MET能力显著相关。伪时间轨迹分析进一步揭示了间充质成纤维细胞（MFs）向supraspinous_KCs转化的MET过程，且GRHL2表达与MET标志物变化一致。分子对接筛选出小白菊内酯、MG-132、米托蒽醌和伊立替康作为潜在靶向GRHL2的药物。免疫荧光实验验证了NPWT处理后DFU临床样本中GRHL2蛋白表达上调。该研究发表在《Immunobiology》。
**主要技术方法**
1. **数据来源**：GSE80178、GSE134431（常规DFU患者bulk RNA-seq）、GSE272918（NPWT处理前后DFU患者bulk RNA-seq）、GSE165816（8例DFU愈合者与5例未愈合者scRNA-seq）。
2. **差异分析与机器学习**：使用“limma”包进行差异表达分析；通过SVM-RFE、LASSO（10折交叉验证）、随机森林、XGBoost四种算法筛选关键基因。
3. **单细胞分析**：使用“Seurat”包进行降维聚类、细胞类型注释；GSVA和AddModuleScore评估MET能力；CytoTRACE和“Monocle2”伪时间轨迹分析推断分化潜能与转化轨迹。
4. **分子对接**：利用Enrichr平台筛选靶向GRHL2的药物，AutoDock Vina进行分子对接。
5. **免疫荧光**：对3例DFU患者NPWT治疗前后伤口边缘组织进行GRHL2蛋白检测。
**研究结果**
**3.1 GRHL2是NPWT激活的关键效应因子**
通过差异分析，在常规DFU患者中发现975个失调基因（530个上调、445个下调）；NPWT处理后鉴定出528个差异表达基因（201个上调、327个下调）。将NPWT激活的机械应力相关基因与DFU失调基因取交集，得到48个基因。四种机器学习算法均筛选出GRHL2，提示其为NPWT激活的关键因子。
**3.2 GRHL2主要在皮肤组织中表达**
利用HPA数据库，GRHL2在RNA和蛋白水平均高表达于皮肤，且在HaCaT细胞系中定位于细胞核、微管和内质网。
**3.3 scRNA-seq揭示GRHL2特异性表达于角质形成细胞**
对13例DFU样本（8例愈合者、5例未愈合者）的scRNA-seq分析，鉴定出10种细胞类型。GRHL2主要在KCs中表达，且未愈合者样本中KCs和巨噬细胞比例较高。
**3.4 GRHL2表达与supraspinous_KCs相关**
KCs分为Basal_KCs、Spinous_KCs和supraspinous_KCs。愈合DFU中supraspinous_KCs比例较高。GSVA分析显示supraspinous_KCs富集于MET相关通路；AddModuleScore评分证实其MET能力最高。相关性分析表明，在愈合DFU中GRHL2表达与supraspinous_KCs的MET能力显著正相关。
**3.5 间充质成纤维细胞具有高分化潜能**
成纤维细胞分为MFs、PIFs、SPFs和SRFs。未愈合者中PIFs比例高，MFs比例低。CytoTRACE分析显示MFs具有更强的分化潜能，提示其可能是参与MET的主要成纤维细胞亚型。
**3.6 GRHL2驱动MFs转化为supraspinous_KCs**
伪时间轨迹分析构建了MFs向supraspinous_KCs的分化轨迹。随着伪时间增加，MFs标志物（FN1、VIM、ZEB2）表达下降，supraspinous_KCs标志物（CDH1、CLDN1、CLDN4）表达上升，且GRHL2表达升高时伴随这一转变。
**3.7 靶向GRHL2的潜在药物筛选与对接**
Enrichr平台筛选出小白菊内酯（结合能-6.09 kcal/mol）、MG-132（-12.05 kcal/mol）、米托蒽醌（-9.10 kcal/mol）和伊立替康（-7.89 kcal/mol）可能靶向GRHL2。
**3.8 免疫荧光验证NPWT激活GRHL2表达**
DFU患者NPWT治疗前后组织免疫荧光显示，治疗后GRHL2蛋白表达显著升高。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次整合多组学与机器学习，发现GRHL2是NPWT激活的关键效应因子。通过单细胞分辨率构建了“MFs→supraspinous_KCs”的MET模型，补充了NPWT通过调控细胞命运决定促进伤口愈合的分子机制。该“NPWT-GRHL2-MET-细胞转化”信号轴将物理刺激的生物学效应从宏观组织修复表型深化至微观细胞转化水平。研究结论为：NPWT通过激活GRHL2，驱动MFs向supraspinous_KCs的MET，从而加速DFU再上皮化，为慢性伤口修复提供了新靶点。
