《International Journal of Biological Macromolecules》：Computer-aided multi-shell electrostatic remodeling of BhS7Xyl for enhanced activity and Thermostability
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摘要具有高催化效率及环境稳定性的木聚糖酶对于木质纤维素生物量的高效利用至关重要，但许多酶在工业加工中所需的碱性及高温条件下会迅速失活。本研究采用计算引导的理性设计策略，旨在提升碱性木聚糖酶BhS7Xyl的催化性能与稳定性。通过恒pH分子动力学模拟、等温压缩率扰动分析以及ECNet
摘要
具有高催化效率及环境稳定性的木聚糖酶对于木质纤维素生物量的高效利用至关重要，但许多酶在工业加工中所需的碱性及高温条件下会迅速失活。本研究采用计算引导的理性设计策略，旨在提升碱性木聚糖酶BhS7Xyl的催化性能与稳定性。通过恒pH分子动力学模拟、等温压缩率扰动分析以及ECNet辅助的适应性预测，确定了需进行工程改造的碱性敏感及结构不稳定的残基。三重突变体H51R/D150N/E287K表现出最佳的整体性能，其比活性达1045.29 U/mg，相比野生型提升了3.73倍。该突变体的熔点从55.82℃上升至64.58℃，在pH 10.0条件下的半衰期从33.96分钟延长至95.84分钟，而在75℃条件下的热半衰期则从10.97分钟提升至215.42分钟，提升了19.64倍。结构分析表明，H51R/D150N/E287K性能的提升得益于更连续的木六糖结合界面、更多的氢键作用、额外的静电/极性相互作用、更强的局部相互作用网络，以及更好的局部热扰动消散能力。在优化的水解条件下，该三重突变体从标准木聚糖、玉米芯木聚糖及硬木浆木聚糖中产生的木糖和低聚木糖含量均高于野生型。这些研究结果表明，多壳层静电重构是一种提升木聚糖酶活性、碱耐受性及热稳定性的有效策略，有助于低聚木糖的生产。
引言
木质纤维素生物量是一种重要的可再生碳资源，其高效转化是发展可持续生物制造及第二代生物燃料的关键[1]。然而，纤维素、半纤维素与木质素之间的紧密结合限制了其直接利用，通常需要经过预处理及酶辅助分解[2]。木聚糖是许多植物细胞壁中主要的半纤维素多糖，而木聚糖酶可通过催化木聚糖主链中的β-1,4-糖苷键断裂，生成木糖及低聚木糖[3]。木聚糖酶属于多种糖苷水解酶家族，其中GH10和GH11类酶因其较高的催化效率、结构多样性及工业应用价值而备受关注[4]。CAZy分类系统为研究碳水化合物活性酶的序列、结构与催化功能提供了有力框架[5]。
木聚糖酶已在食品加工、纸浆造纸漂白、饲料改良、纺织加工以及生物质转化等领域得到广泛研究[6]。在纸浆造纸行业中，木聚糖酶可降低化学漂白的需求，同时提升工艺的环境友好性[7]。在食品及生物质利用领域，酶法木聚糖水解因能在更温和的条件下进行且产品选择性优于化学水解，因而特别适合用于低聚木糖的生产[8]。此外，为进一步提升低聚木糖的生产效率及工艺稳定性，人们还开发了连续流及固定化木聚糖酶系统[9]。因此，玉米芯等富含木聚糖的农业工业废弃物，成为生产功能性寡糖及可发酵糖类的优质原料[10]。
尽管具有上述优势，但许多木聚糖酶在工业过程中常见的高温及碱性条件下仍不够稳定。近期研究表明，通过理性突变可提升耐热及耐碱的GH10类木聚糖酶的性能，但同时实现高活性、强碱耐受性与良好热稳定性的目标仍面临挑战[11]。来自耐盐芽孢杆菌S7的碱性活性内切β-1,4-木聚糖酶BhS7Xyl，因其天然的碱性活性及工业应用潜力，成为理想的工程改造靶标[12]。碱性木聚糖酶的pH适应性与其催化位点及表面残基周围的静电环境密切相关，这类环境因素会影响催化剂的pKa值、氢键形成以及构象稳定性[13]。因此，通过重新设计表面电荷已成为稳定酶蛋白的有效方法[14]。从更广的角度来看，pH响应型蛋白质设计表明，通过有针对性的静电重构，可在特定环境应力作用下改变蛋白质的构象行为[15]。
近年来，人工智能辅助的蛋白质设计及计算稳定性工程技术的进步，极大推动了高性能工业酶的开发，为打破长期以来存在的活性与稳定性之间的矛盾提供了新思路。基于深度学习的适应性预测模型以及从头设计的酶合成策略，大幅扩展了理性工程设计的工具箱，使得无需依赖大规模筛选库即可精准筛选出有益突变[16]。与此同时，结合分子动力学模拟、结构生物信息学与机器学习的技术流程，已被证明能有效同步优化工业生物催化剂的催化活性、pH适应能力及热稳定性，为本研究提供了可靠的方法学依据[17]。目前已有多种工程策略被用于提升木聚糖酶的性能，包括基于结构的理性设计[18]、催化位点或周围残基的突变改造[19]、定向耐热性工程改造[20]、二硫键引入[21]以及结构环的刚性化处理[22]。然而，许多现有方法仍依赖于静态结构分析、经验性的残基选择或大规模突变库，可能无法充分考虑pH变化带来的电荷波动以及碱性应力下的动态不稳定性。虽然计算结构分析有助于深入理解木聚糖酶的功能机制，但目前仍需一种能够将碱性状态下的动态变化、残基层面的不稳定性、突变适应性预测与实验验证相结合的工作流程[23]。本研究采用恒pH分子动力学模拟、等温压缩率扰动分析、ECNet辅助的适应性预测以及实验验证相结合的集成策略，对BhS7Xyl进行了工程改造。该工作流程确定了H51、D150和E287这三个关键的工程改造位点，随后对三重突变体H51R/D150N/E287K的催化活性、热稳定性、碱耐受性、底物结合能力、分子动力学行为以及低聚木糖生成能力进行了系统研究。
章节要点
构建用于提升热稳定性的突变体文库
首先使用AlphaFold2[22]预测了成熟BhS7Xyl肽的三维结构（包含1–350号残基，未计入C端的His标签），该结构作为后续所有计算分析的初始模型。预测结果的置信度非常高：所有残基的pLDDT值均≥90，属于AlphaFold2定义的最高置信等级。各残基的pLDDT具体数值详见补充表S7。对该预测模型进行了进一步核查
识别并计算评估碱性敏感位点
在本研究中，我们首先采用基于恒pH分子动力学的等温压缩率扰动工程策略（iCASE），对木聚糖酶BhS7Xyl进行了全原子尺度的结构稳定性分析（见图1A）。在pH 10.0、压力为0.1 MPa的极端碱性条件下，通过对所有蛋白质残基的质子化状态坐标进行长期监测，发现蛋白质表面的静电势场存在显著的不均匀波动。某些残基
结论
综上所述，本研究通过整合计算与实验方法，提升了BhS7Xyl在碱性及高温条件下的性能。通过动态不稳定性分析、适应性预测及实验验证，确定H51、D150和E287为关键的工程改造位点。由此得到的三重突变体H51R/D150N/E287K，在催化活性、热力学稳定性、碱耐受性及热耐受性方面均优于野生型。从结构层面来看
CRediT作者贡献说明
Chunlin Tan：论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——初稿，方法学研究，资金获取，概念构思。Xin Yu：数据整理，方法学研究，软件应用，结果验证，可视化处理，论文撰写——审阅与编辑。Lanxi Sun：论文撰写——初稿，方法学研究，实验研究，数据整理。Tianhang Pang：论文撰写——初稿，方法学研究，实验研究，数据整理。Qianfeng Chen：资源准备，实验研究，定量分析。Linyu Luo：论文撰写——初稿，方法学研究，
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：32400068、22508305）中国博士后科学基金会（编号：GZC20230332、2025T180738）以及四川省博士后创新人才资助计划（编号：BX202318）的支持。
Chunlin Tan|Xin Yu|Lanxi Sun|Tianhang Pang|Qianfeng Chen|Linyu Luo|Wensheng Tao|Mengfei Long
