不同物种及加工方式对鱼类过敏原谱的影响差异：一种用于提升海产品安全性、过敏诊断与管理的整合组学分析方法

《International Journal of Biological Macromolecules》：Species-specific and processing-dependent fish allergen profile diversities: An integrated omics workflow for improving seafood safety, allergy diagnosis and management

　　•已建立用于解析鱼类各类过敏原的完整工作流程。•明确了8种鱼类的过敏原组，其中包括通过计算机预测得到的过敏原。•鱼类过敏原特征具有高度的物种特异性以及加工依赖性。•微球蛋白的含量差异可达7倍，其中鲭鱼的含量始终最低。•不同的热处理方式会产生不同的过敏原特征。引言食物过敏在全球范围内日益严重，某些地区的患病率高达普通人群的10%[1]。这一趋势伴随着敏感化模式和饮食暴露情况的地域差异，凸显出有必要针对不同地区识别和表征致敏性食物来源[2]。根据联合国粮食及农业组织与世界卫生组织的统计，鱼类和贝类是全球八大主要食物过敏原之一[3]。海鲜过敏的诊断与管理极为复杂且具有挑战性，大多数患者终生需遵守严格的饮食限制，同时面临致命性过敏反应的高风险[4]、[5]、[6]。尤其是鱼类，是全球消费最广泛的海洋食品之一。以亚太地区为主的水产养殖业发展迅速，占全球产量的92%，其中东亚和东南亚地区起着关键推动作用[7]、[8]。近几十年来，组学技术，尤其是蛋白质组学，已成为用于全面检测和定量过敏原的强大分析工具[9]、[10]、[11]、[12]。蛋白质组学有望克服传统食物过敏原检测方法所存在的诸多难题，例如酶联免疫吸附试验。尽管这些方法仍被广泛用于常规监测，但它们存在抗体特异性不足、表位可及性有限，以及难以检测到同工型或意外出现的过敏原等问题[13]、[14]。相比之下，蛋白质组学能够全面呈现提取出的蛋白质组信息，从而追踪分子层面的变化。应用于鱼类等过敏原时，这一优势尤为明显，因为致敏蛋白的具体身份及其含量都会影响整体的致敏性。此外，虽然ELISA是一种针对性很强的检测方法，但蛋白质组学则能深入分析食品加工过程中引发的改变，比如因蛋白质聚集导致的损失，或是提取物中某些蛋白质浓度的变化。基于质谱技术的蛋白质组学方法，如液相色谱-质谱/质谱，可实现无偏倚、高分辨率的致敏蛋白定量分析，识别同工型差异，并能在复杂的食品基质和加工样本中精准检测出过敏原[15]、[16]。这些功能使得蛋白质组学不仅成为发现过敏原的重要工具，还能用于分子风险评估和质量控制，从而有助于实现标准化过敏原表征监管框架的目标。由于海鲜种类繁多，其众多致敏蛋白的表达方式和同工型也存在很大差异，这给过敏原的检测和表征带来了困难[17]。与许多常见食物过敏原不同，鱼类过敏原组（此处指基于各物种内的识别和定量结果而确定的、经世界卫生组织/国际免疫学会联盟认可的或候选的鱼类过敏原的完整集合）受多种因素影响，包括高度的物种特异性以及蛋白质组层面的差异[18]、[19]。目前，世界卫生组织/国际免疫学会联盟过敏原命名小组已确认21种鱼类中的12种鱼类过敏原（微球蛋白、β-烯醇化酶、醛缩酶A、肌动球蛋白、卵黄蛋白、胶原蛋白、肌酸激酶、三磷酸异构酶、类似丙酮酸激酶的PKM酶、L-乳酸脱氢酶、葡萄糖6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶）[20]。尽管微球蛋白作为一种钙结合蛋白，被广泛认为是导致广泛交叉反应的主要鱼类通用过敏原，但众多研究也发现了其他具有显著物种特异性、多样同工型特征，且在不同鱼类中含量差异较大的过敏原[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。然而，现有的大多数鱼类过敏原研究主要集中在欧洲和北美的鱼类物种上，而这些物种仅占全球2000多种食用鱼类的很小一部分[26]。这种地理和分类学上的偏差限制了现有过敏原数据集的普遍适用性，也影响了人们对亚太地区等代表性不足区域的特定过敏原特征的认知，因为这些地区的食用习惯和敏感化模式存在明显差异[27]。此外，先前的研究还发现，用于皮肤点刺试验的商业诊断提取物中，过敏原的特征和含量存在较大差异，这反映了物种选择和提取物制备方法的区别[28]。在本研究中，选择了8种鱼类作为代表，涵盖了亚太地区具有商业价值且广泛食用的鱼类，其中包括主要的水产养殖物种（亚洲海鲈、橙斑石斑鱼、马拉巴尔红鲷鱼和金鲷鱼）、常见的沿海食用鱼类（黑线鱼和白线鱼）、在越南和孟加拉国广泛养殖和食用的全球贸易型淡水鲶鱼，以及东亚地区广泛食用的营养价值较高的大西洋沙鮻鱼（见图1）[7]、[27]、[29]。这些物种涵盖了不同的分类群、市场类别、水产养殖重要性以及预期的过敏原组变异程度，从而为评估现有参考提取物和诊断试剂盒是否能够准确反映当地的海鲜暴露情况提供了具有区域代表性的依据。除了物种多样性之外，鱼类过敏原还表现出多样的生化特性以及不同的热稳定性[30]、[31]。鉴于鱼类的食用形式多种多样，从生食到各种热处理方式都有，这一点尤为重要。热处理会引发复杂的分子变化。虽然像微球蛋白这样的过敏原具有热稳定性，但其他蛋白质则会发生变性，这可能会破坏原有的表位，或者暴露出新的表位。此外，热处理引起的蛋白质聚集会增加其抵抗胃肠道消化的能力，从而使完整的过敏原更容易到达免疫系统，进而可能增强致敏性[32]。相反，在某些情况下，烹饪反而可能提高蛋白质的消化率，这说明不同的致敏蛋白在热应力作用下的表现各不相同。鉴于煮熟的鱼类及加工过的鱼类产品被广泛食用，了解热处理如何影响过敏原的丰度和组成对于准确评估鱼类过敏原的风险、为开发具有代表性的诊断用过敏原提取物提供依据具有重要意义。综合来看，这些因素都表明，在鱼类过敏原的分子层面表征方面还存在诸多不足，从而影响了对具有区域代表性的过敏原组的准确描述。随着全球鱼类消费量的持续上升，深入理解鱼类过敏原的组成对于保障食品安全、进行临床诊断以及为消费者提供指导而言愈发重要。尽管蛋白质组学在食物过敏研究中得到了广泛应用，但针对不同鱼类物种之间过敏原变异性的全面定量蛋白质组学研究仍然十分有限[27]、[33]、[34]、[35]。与以往主要聚焦于少数参考物种、单个过敏原或单一加工条件的研究不同，据我们所知，这是首项利用液相色谱-质谱/质谱蛋白质组学方法系统比较多种鱼类中过敏原相对丰度，并同时评估两种不同热处理方式的研究。本研究开发了一种整合了免疫学、蛋白质组学和生物信息学方法的流程，用于表征鱼类过敏原组。该设计能够同时评估具有物种特异性的过敏原组、蛋白质提取过程中的加工依赖性变化，以及潜在过敏原的识别。通过生成不同物种和加工条件下的过敏原特征分子谱型，本研究为改进鱼类过敏原风险评估提供了可行的框架，有助于开发更标准化的诊断方法，进而制定基于证据的、针对不同地区的临床管理策略，为鱼类过敏患者提供饮食指导。章节节选采样从新加坡的一家当地海鲜供应商处获得了8种鱼类的各3个新鲜完整标本：鲶鱼（swai；Pangasianodon hypophthalmus）、亚洲海鲈（barramundi；Lates calcarifer）、白线鱼（Eleutheronema tetradactylum）、黑线鱼（Leptomelanosoma indicum）、金鲷鱼（Trachinotus blochii）、马拉巴尔红鲷鱼（Lutjanus malabaricus）、橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）以及大西洋沙鮻鱼（Scomber scombrus）。比较总蛋白质和微球蛋白谱型及IgE结合模式SDS-PAGE分析显示，经过热处理后，不同物种的总蛋白质谱型以及过敏原组存在明显的物种特异性和可提取性差异（见图3）。在RE条件下，所有物种都呈现出复杂的条带图案，在约100 kDa（胶原蛋白）、约60 kDa（GPI和丙酮酸激酶）、35–50 kDa（L-乳酸脱氢酶、GAPDH、肌动球蛋白、醛缩酶、肌酸激酶和烯醇化酶）、约25 kDa（TPI）以及10–15 kDa（微球蛋白）区域均可见明显的条带。不同物种之间的条带存在明显差异。结论已解析出高度物种特异性的鱼类过敏原特征，这些特征无法用单一的通用鱼类过敏原谱型来准确表示。定量蛋白质组学分析显示，8种鱼类之间的过敏原丰度、同工型分布以及整体蛋白质组组成存在显著差异。尽管微球蛋白在大多数物种中仍占主导地位，但其含量差异很大，而其他过敏原在不同物种中的贡献程度也不尽相同。热处理进一步CRediT作者贡献声明Renee Chin：撰写——初稿、可视化、方法学、研究、正式分析、数据整理、概念构建。Janitha Iddagoda：撰写——审阅与编辑、方法学、研究、正式分析、数据整理。Sahel Heidari：撰写——审阅与编辑、研究。Shaymaviswanathan Karnaneedi：撰写——审阅与编辑、方法学、研究。Vachiranee Limviphuvadh：撰写——审阅与编辑、研究、正式分析、数据整理。Afifah Sean：关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明使用了ChatGPT 5.5（OpenAI）和Claude Opus 4.6来提升手稿的语言表达和可读性。使用这些工具后，作者们对所有内容进行了审阅和修改，并对最终发表文章的内容负全责。资金来源本研究得到了以下机构的资助：美国良好食品研究所的研究基金项目（“以已知过敏原特征的养殖海鲜的安全性评估为基准的鱼类组织蛋白质组学研究”）、新加坡国家研究基金会以及新加坡科学、技术和研究局在“新加坡食品故事”研发计划下的资助（W22W3D0003），还有澳大利亚国家健康与医学研究委员会的支持（GNT1086656）。这些资助方在研究过程中未发挥任何作用。利益冲突声明作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。致谢J.I.和R.C.拥有新加坡詹姆斯库克大学提供的全日制博士学位奖学金。S.H.则获得澳大利亚詹姆斯库克大学与食品过敏研究中心共同提供的全日制博士学位奖学金。S.K.是该中心的博士后研究员。作者们还要感谢Igloo Food公司和Melvin先生在协助获取标本方面的帮助。图表的制作使用了Biorender软件（出版许可地址：https://BioRender.com/vll0l55）。Renee Chin|Janitha Iddagoda|Sahel Heidari|Shaymaviswanathan Karnaneedi|Vachiranee Limviphuvadh|Afifah Sean|Kok Wee Chong|Lynette Liling Tan|Xin Shan Lim|Zhenzhao Li|Michael G. Leeming|Nicholas A. Williamson|Sebastian Maurer-Stroh|Dianne E. Campbell|Andreas L. Lopata|Thimo Ruethers