《International Journal of Biological Macromolecules》：Dual-site CRISPR/Cas9-mediated mutations in Toll-like receptor 4 (TLR4): complete characterization reveals divergent autophagic reprogramming of LPS-related downstream activities
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双位点CRISPR-Cas9编辑Toll样受体4（TLR4）破坏脂多糖（LPS）介导的下游信号。结构建模显示受体结合几何形状减少17%。CRISPR编辑的细胞抑制活性氧（ROS）生成和下游凋亡级联反应。TLR4的破坏选择性解偶联代谢性自噬流谱。靶向TLR4编辑
双位点CRISPR-Cas9编辑Toll样受体4（TLR4）破坏脂多糖（LPS）介导的下游信号。结构建模显示受体结合几何形状减少17%。CRISPR编辑的细胞抑制活性氧（ROS）生成和下游凋亡级联反应。TLR4的破坏选择性解偶联代谢性自噬流谱。靶向TLR4编辑下调主要经典炎症基因。
**研究背景与问题**
Toll样受体4（TLR4）是先天免疫系统识别革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）的关键跨膜受体，其过度激活会引发失控性炎症反应，导致脓毒症、自身免疫病和组织损伤。尽管已有大量研究，TLR4结构的细节，特别是跨膜域（TM）和TIR域（Toll/白细胞介素-1受体同源域）在二聚化中的精确构象，以及不同脂质A化学型对LPS结合的影响，仍不完全清楚。传统基因敲除虽能消除病理性炎症，但也同时破坏基础免疫监视功能。因此，需要一种选择性调控策略，在保留部分保护性信号的同时抑制过度炎症。本研究利用CRISPR-Cas9在TLR4的胞外域（ECD）和TIR域引入双位点突变，旨在解析其如何重新编程LPS下游信号通路，特别是自噬重编程的作用。
**研究内容与结论**
研究人员在RAW264.7巨噬细胞中通过CRISPR-Cas9介导的双位点编辑，在TLR4基因的ECD（M209I、V254I、E593D）和TIR域（R761H）产生点突变，利用全基因组测序（WGS）、扩增子NGS和T7EI酶切验证编辑效率，结合AlphaFold预测和分子动力学（MD）模拟分析结构变化，通过透射电镜（TEM）观察超微结构，采用RNA-seq、基因集富集分析（GSEA）、qPCR、Western blot、ELISA、流式细胞术、荧光报告系统等多模态技术系统表征下游信号、炎症、氧化应激、凋亡和自噬。研究发现，双位点突变导致TLR4-MD2-LPS结合腔体积减少约17%，削弱NFκB核转位和下游炎症基因表达，抑制ROS生成和凋亡级联，同时增强自噬流并促进修复性代谢重编程，将巨噬细胞从促炎状态转向适应性修复状态。该论文发表在《International Journal of Biological Macromolecules》，为设计免疫调控策略提供了新靶点和新机制。
**主要技术方法**
主要技术方法包括：CRISPR-Cas9基因编辑（sgRNA设计、RNP脂质体转染）结合高通量全基因组测序（Illumina NextSeq 1000）和扩增子NGS验证编辑结果；AlphaFold预测突变蛋白三维结构，辅以GROMACS进行分子动力学模拟（200 ns）；透射电子显微镜（Tecnai F30）观察细胞超微结构；RNA测序（Illumina NovaSeq X）和GSEA分析转录组；免疫荧光（共聚焦显微镜和Fluoroskan微孔板荧光计）检测NFκB转位及信号蛋白；双荧光素酶报告基因（NFκB和TFEB）及LC3-HiBiT自噬报告系统评估转录活性与自噬流；流式细胞术（ROS、caspase-3、Annexin V/7-AAD、JC-1）分析氧化应激和凋亡；Western blot和ELISA验证蛋白表达和细胞因子水平。所有细胞均来源于ATCC的RAW264.7巨噬细胞系。
**研究结果**
**2.1 CRISPR/Cas9编辑效率在Raw264.7巨噬细胞中**：通过WGS、扩增子NGS和T7EI酶切分析，确认CRISPR编辑成功，检测到大量SNP、插入、缺失和移码突变，编辑效率高。
**2.2 高密度CRISPR诱导突变跨TLR4位点**：扩增子NGS（~75×覆盖深度）在TLR4基因编码区鉴定出80余个变异，包括高频SNP和移码插入缺失，并筛选出四个共识氨基酸替换（M209I、V254I、E593D、R761H）。
**2.3 AlphaFold特异性结构建模与突变TLR4动力学**：AlphaFold模型显示ECD突变导致LPS结合腔体积从825.41 ?
3降至688.19 ?
3（减少约17%），MD模拟和分子对接表明LPS结合更受限，TIR域R761H突变位于CD环，可能破坏适配体招募。
**2.4 CRISPR-Cas9介导的TLR4破坏增加自噬作为主导细胞反应**：TEM显示，编辑细胞在LPS刺激下膜突起减少，形成自噬体，超微结构更有序，呈现适应性修复表型。
**2.5 TLR4编辑下调所有主要TLR及TLR炎症相关信号基因**：RNA-seq显示，编辑细胞中Tlr1、Tlr2、Tlr3、Tlr6、Tlr7、Tlr9、Il1α、Il1β、Il6、NFκB等显著下调，而Tlr13、Mapk4、Mapk12等上调，GSEA富集分析显示免疫信号通路负富集，生物合成和修复通路正富集。
**2.6 GSEA功能解析LPS存在下CRISPR系统基因调控**：在LPS刺激下，编辑细胞中Tram、Tirap、Tlr4、NFκB、Il6等炎症基因下调，Tlr9、Vegf、Tgfa上调，GSEA显示凋亡信号、细胞因子产生、ERK1/2信号等负富集，ATP依赖的蛋白折叠、线粒体翻译等正富集。
**2.7 高分辨率免疫荧光显示NFκB-p105/p50
Ser337在编辑细胞中转位时空动力学变化**：共聚焦免疫荧光和定量分析表明，编辑细胞中NFκB核转位在LPS刺激后6 h和24 h均显著降低，Western blot和qPCR验证NFκB1蛋白和mRNA水平下降。
**2.8 编辑巨噬细胞炎症介质的多模态表征**：ELISA显示编辑细胞IL-1β显著降低，但IL-6和NO部分保留；免疫组化显示CD14表达降低；Western blot显示TLR4、MyD88、pAKT1、STAT3水平下调，pAKT1/AKT比值降低，表明信号部分解偶联。
**2.9 LPS刺激下编辑巨噬细胞中ROS介导的凋亡模式**：流式细胞术显示编辑细胞ROS生成减少，caspase-3活性在刺激后降低，Annexin V/7-AAD分析显示早期和晚期凋亡比例增加但坏死减少，JC-1检测显示线粒体膜电位降低但在LPS下无额外负担，MAPK信号（pJNK、p38α）减弱。
**2.10 TLR4信号通路的功能表征**：Fluoroskan免疫荧光定量显示，编辑细胞中TLR1、TLR3、TLR4、TLR10、NFκB-p105/p50、pNFκB-p65、MyD88、TRAF6、JNK1/2/3、mTOR、PI3K-p85α、pPI3K、AKT1、pAKT1、ERK1/2、pERK1/2、JAK3、pJAK3、STAT3等信号蛋白在LPS刺激下均显著减弱。
**2.11 双位点靶向TLR4突变重编程NFκB信号、TFEB激活和自噬流**：NFκB报告基因显示编辑细胞对LPS反应迟钝；TFEB报告基因显示编辑细胞对雷帕霉素（mTOR抑制剂）仍高度敏感，但对LPS不反应；LC3-HiBiT自噬报告显示编辑细胞基线自噬流降低，BafA1阻断后积累减少，表明自噬流受损但LPS仍能诱导部分响应。
**总结讨论与结论**
讨论部分强调，本研究首次系统描述了CRISPR-Cas9双位点编辑TLR4产生的具体突变（ECD：M209I、V254I、E593D；TIR：R761H）及其结构后果（结合腔体积减少17%），并发现自噬成为主导响应，而非经典炎症。研究通过TEM、转录组和GSEA首次描述了TLR4编辑巨噬细胞的超微结构特征，包括自噬体形成，以及NFκB核转位减少、CD14独立性、MyD88/STAT3/AKT信号轴减弱等多方面改变。编辑细胞中MAPK磷酸化减弱、ROS生成减少、凋亡转向自噬，表明TLR4部分失活能将巨噬细胞重编程为修复性状态。论文结论翻译如下：**治疗性抗炎策略的主要目标是安全地调控LPS-TLR4相互作用，从而抑制下游NFκB和MAPK信号级联，防止先天免疫过度激活导致的组织损伤。然而，全局敲除TLR4基因虽消除病理性炎症，但也同时抹去保护性的基础免疫监视功能。本研究提供了新的见解，表明域特异性双位点破坏可以选择性将巨噬细胞重编程为倾向于应激适应和修复的状态，而非单纯沉默受体。通过联合免疫荧光、报告基因和裂解追踪实验，本研究确立了TLR4作为RAW巨噬细胞中协调炎症转录、溶酶体程序和自噬流的上游中枢调控因子。部分破坏该结构会瓦解经典内毒素驱动的通路，使细胞对LPS刺激高度不应答，同时保留下游代谢感应级联（如雷帕霉素介导的TFEB激活）的灵活性和功能性。最终，这些发现表明，靶向结构编辑TLR4成功地将下游自噬和转录因子从常规的过度炎症免疫控制网络中解偶联。**
