《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Fisetin alleviates zinc overload-induced intestinal injury by inhibiting ferroptosis and remodeling gut microbiota in weaned piglets
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高剂量氧化锌(ZnO)能有效预防断奶仔猪断奶后腹泻并促进生长，但引发了关于肠道损伤、代谢紊乱以及促使细菌产生耐药性风险的担忧。本研究旨在寻找能够减轻锌毒性的非螯合多酚(non-chelating polyphenols)并阐明其保护机制，重点关注对铁死亡(fe
高剂量氧化锌(ZnO)能有效预防断奶仔猪断奶后腹泻并促进生长，但引发了关于肠道损伤、代谢紊乱以及促使细菌产生耐药性风险的担忧。本研究旨在寻找能够减轻锌毒性的非螯合多酚(non-chelating polyphenols)并阐明其保护机制，重点关注对铁死亡(ferroptosis)的抑制作用。网络毒理学预测铁死亡是锌诱导肠道损伤的核心机制，该结果在肠道上皮细胞中得到证实，即锌过载特异性诱导铁死亡，而未激活细胞凋亡(apoptosis)、坏死性凋亡(necroptosis)或自噬(autophagy)。在多种多酚中，非瑟素(fisetin, FIS)被鉴定为一种非螯合候选物，它能够减轻锌诱导的细胞毒性，保留紧密连接蛋白(tight junction proteins)，并在体外激活Nrf2-GPX4轴(Nrf2-GPX4 axis)以抑制铁死亡。在锌过载的断奶仔猪中，补充FIS维持了高剂量锌的促生长作用，同时改善了肠道损伤。FIS还减轻了空肠的氧化应激(oxidative stress)，缓解了炎症反应，并抑制了铁死亡。此外，FIS重塑了肠道菌群(Gut microbiota)，富集了有益类群Romboutsia（与生长性能正相关）和Clostridium_sensu_stricto_1（与p-Nrf2/Nrf2比值正相关），同时抑制了锌富集的Anaerovibrio（与GPX4蛋白表达负相关）。FIS还将微生物代谢途径转向氨基酸(amino acid)和萜类化合物(terpenoid)代谢，这可能有助于观察到的铁死亡防御。结论：FIS通过双重调节，即激活Nrf2-GPX4轴抑制铁死亡和重塑肠道菌群以加强这一防御，从而缓解高剂量ZnO诱导的断奶仔猪肠道损伤。通过保留锌的促生长益处同时减轻其毒性，FIS代表了一种有前景的可持续养猪生产的营养策略。
在畜牧生产中，断奶仔猪常面临多重应激，导致腹泻和生长受阻。高剂量氧化锌(ZnO，2,000–3,000 mg/kg)被广泛用于控制断奶后腹泻并促进生长，但其具有双刃剑效应。长期或高剂量使用ZnO不仅会破坏矿物质稳态(如铁、铜)并诱导肝脏线粒体功能障碍，还会引起肠道损伤和代谢紊乱。肠道是锌吸收的主要部位，也是免疫和微生物稳态的关键界面。研究表明，锌过载会显著改变断奶仔猪的肠道菌群组成，而肠道菌群失调会增加肠道通透性，促进细菌移位并引发全身炎症。在细胞水平上，已有证据表明锌过载会诱导铁死亡(一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的细胞死亡形式)，这可能破坏上皮完整性并加剧肠道损伤。许多多酚类化合物具有抗氧化、抗炎和屏障保护特性，并可抑制铁死亡，但部分多酚会螯合金属离子，可能干扰锌稳态。因此，寻找不螯合金属离子且能对抗铁死亡和重塑菌群的非螯合多酚成为一种新型策略。为此，研究人员开展了一项研究，旨在从多酚库中筛选出非螯合多酚，评估其对锌过载诱导肠道损伤的保护作用，并探索其抑制铁死亡和改善肠道屏障功能的机制，以为缓解高剂量锌毒性提供科学依据。该研究的成果对于在保留高剂量锌促生长益处的同时减轻其毒副作用、促进生猪可持续生产具有重要意义，论文发表在《Journal of Animal Science and Biotechnology》。
研究人员主要采用了网络毒理学、体外细胞实验和体内动物实验相结合的关键技术方法。通过网络毒理学预测锌与肠道损伤的交集基因并构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络以识别核心基因和通路。体外使用IPEC-J2细胞进行多酚筛选和机制验证。体内实验将30头25日龄断奶仔猪(杜长大三元)随机分为对照组、锌过载组和锌过载+FIS组，开展14天的饲养试验后采集空肠和盲肠内容物样本。随后运用组织染色、免疫荧光、免疫印迹、试剂盒检测及16S rDNA测序等技术进行综合分析。
网络毒理学揭示锌诱导肠道损伤涉及多种细胞死亡途径：通过分析锌与肠道损伤的交集基因，发现7个核心基因，富集分析发现白细胞介素(IL)信号通路等，并特别指出凋亡、铁死亡、坏死性凋亡和自噬等程序性细胞死亡通路被显著富集。
铁死亡是锌过载在IPEC-J2细胞中诱导的主要细胞死亡途径：通过免疫印迹等检测发现，锌过载显著上调铁死亡相关基因PTGS2和HO-1，下调GPX4，并增加脂质过氧化，但未激活凋亡、坏死性凋亡或自噬的关键分子标记。使用铁死亡抑制剂有效恢复了细胞活力，证实铁死亡是核心机制。
筛选鉴定FIS为保护肠道屏障的非螯合多酚：通过对22种多酚的初步和二级筛选，发现非瑟素(FIS)不螯合锌且能最有效缓解锌诱导的细胞毒性。FIS显著恢复了紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin1的表达，展现出优于其他多酚的抗氧化和抗炎活性。
FIS在IPEC-J2细胞中通过激活Nrf2-GPX4轴抑制铁死亡：研究表明，FIS处理上调了GPX4蛋白表达，恢复了p-Nrf2与Nrf2的比值及核内Nrf2水平，从而抑制了由锌过载诱导的脂质过氧化与铁死亡。
FIS改善锌过载仔猪生长性能和肠道形态：在动物实验中，FIS不仅维持了高剂量锌带来的促生长效应(如提高平均日增重和降低耗料增重比)，还显著改善了锌过载引起的空肠绒毛侵蚀、微绒毛变短、线粒体嵴丢失等超微结构损伤，并降低了血清肠道通透性标志物DAO和D-乳酸的水平。
FIS缓解锌过载诱导的肠道氧化应激、铁死亡与炎症：在仔猪空肠组织中，FIS有效降低了活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平，提升了总抗氧化能力(T-AOC)。同时，FIS逆转了GPX4、p-Nrf2/Nrf2比值及核内Nrf2的蛋白表达下降，并显著降低了肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症因子的浓度。
FIS调节锌过载仔猪肠道菌群：测序分析表明，FIS重塑了盲肠微生物群落，使有益菌属Romboutsia和Clostridium_sensu_stricto_1显著富集，而抑制了由锌富集的Anaerovibrio。
FIS诱导的肠道菌群建模与改善宿主表型和铁防御相关：Spearman相关性分析显示，Romboutsia与生长性能正相关，Clostridium_sensu_stricto_1与p-Nrf2/Nrf2比值正相关，而Anaerovibrio与GPX4蛋白表达负相关。功能预测显示，FIS将微生物代谢途径从碳水化合物代谢转变为氨基酸和萜类代谢，从而协同增强铁死亡防御。
在讨论部分，研究人员总结认为，本研究系统阐明了高剂量锌诱导肠道损伤的机制，FIS作为一种非螯合多酚，在不影响锌促生长作用的前提下，通过激活Nrf2-GPX4轴直接抑制铁死亡，并通过重塑肠道菌群(如富集产生短链脂肪酸的菌属、抑制脂解菌属)间接加强这一防御机制。研究还揭示了高剂量ZnO带来的生态风险，如富集耐药相关类群，而FIS能有效规避这一风险。研究结论指出，FIS通过双重调节机制，即直接细胞保护和间接生态调节，缓解了高剂量锌诱导的断奶仔猪肠道损伤，成为一种具有广阔前景的可持续生猪生产营养策略。
