细胞外半乳糖凝集素-3/碳水化合物相互作用调节癌细胞迁移

《International Journal of Molecular Sciences》：Extracellular Galectin-3/Carbohydrate Interactions Modulate Cancer Cellular Migration

　　

摘要：半乳糖凝集素-3（Galectin-3）介导的过程在癌症进展的许多方面具有重要意义，但对其机制尚不完全清楚。半乳糖凝集素-3存在于细胞外，由于其碳水化合物识别域（CRD）和非结构化N端结构域（NTD），半乳糖凝集素-3发生多聚化，从而影响诸如碳水化合物调控的细胞-细胞相互作用等事件。本文报道的体外伤口愈合实验研究表明，外源性半乳糖凝集素-3抑制癌细胞迁移。由于不含NTD的半乳糖凝集素-3 CRD的添加并未阻止细胞迁移，研究人员将全长半乳糖凝集素-3对迁移的影响归因于多聚化全长半乳糖凝集素-3与细胞外受体之间的细胞外相互作用。在本论文中，乳糖功能化的树枝状聚合物作为半乳糖凝集素-3的多价结合伙伴，用于减轻细胞外多价半乳糖凝集素/碳水化合物相互作用。添加乳糖功能化树枝状聚合物在外源性半乳糖凝集素-3存在下显著恢复细胞迁移，且不增加细胞活力。因此，尽管细胞内的半乳糖凝集素-3/蛋白质相互作用已知可增加细胞迁移和活力，但细胞表面的半乳糖凝集素-3/碳水化合物相互作用则具有相反的影响，即降低细胞迁移。

**论文解读：细胞外半乳糖凝集素-3/碳水化合物相互作用对癌细胞迁移的调节作用**

**1. 研究背景与问题**

半乳糖凝集素-3（Galectin-3）是一种β-半乳糖苷结合蛋白，属于凝集素家族中嵌合体亚型的唯一成员，由无序的非螺旋胶原样N端结构域（NTD）和C端碳水化合物识别域（CRD）组成。NTD介导半乳糖凝集素-3蛋白的多聚化，形成多价展示以调节碳水化合物结合，而CRD在已知半乳糖凝集素中高度保守。半乳糖凝集素-3存在于细胞质、细胞核及细胞外，其细胞外功能由CRD/碳水化合物结合相互作用调控，而细胞内过程则依赖半乳糖凝集素-3/蛋白质相互作用。半乳糖凝集素-3已被证实参与多种癌症进程，包括肿瘤形成、细胞迁移、血管生成和凋亡。然而，其在癌细胞迁移中的作用机制尚不清楚，尤其是细胞外半乳糖凝集素-3/碳水化合物相互作用与细胞内半乳糖凝集素-3/蛋白质相互作用对迁移的调控方向可能相反。既往研究多集中于细胞内半乳糖凝集素-3/蛋白质相互作用对迁移的促进作用，而细胞外半乳糖凝集素-3/碳水化合物相互作用是否以及如何影响迁移尚未明确。研究人员假设细胞外半乳糖凝集素-3/碳水化合物相互作用通过控制细胞与宿主位点及彼此之间的锚定强度，在癌细胞迁移中发挥重要调节作用。

**2. 研究内容与结论**

研究人员利用乳糖功能化的聚酰胺-胺（PAMAM）树枝状聚合物作为多价结合配体，研究细胞外半乳糖凝集素-3/碳水化合物相互作用对癌细胞迁移的影响。通过体外伤口愈合（划痕）实验，评估了外源性半乳糖凝集素-3及不同代数（G(2)、G(3)、G(4)、G(6)）乳糖功能化树枝状聚合物对DU 145前列腺癌细胞和HT-1080纤维肉瘤细胞迁移的影响。研究发现，外源性半乳糖凝集素-3显著抑制两种细胞的迁移，而添加乳糖功能化树枝状聚合物能够恢复（G(2)、G(3)完全恢复；G(4)、G(6)部分恢复）被半乳糖凝集素-3抑制的迁移。进一步实验表明，仅含CRD（无NTD）的半乳糖凝集素-3无法抑制细胞迁移，说明NTD介导的多聚化对细胞外锚定至关重要。免疫荧光实验显示，半乳糖凝集素-3在细胞间形成网状分布，且乳糖功能化树枝状聚合物可减少细胞表面半乳糖凝集素-3的结合量及内吞比例。细胞活力实验表明，乳糖功能化树枝状聚合物本身无细胞毒性，但与半乳糖凝集素-3联合使用时，细胞活力进一步降低。该研究揭示了细胞外半乳糖凝集素-3/碳水化合物相互作用通过交联细胞抑制迁移，而乳糖功能化树枝状聚合物通过竞争性结合半乳糖凝集素-3解除交联，从而恢复迁移，但过度解除交联会降低细胞活力。研究发表在《International Journal of Molecular Sciences》。

**3. 关键技术方法**

研究主要采用以下技术方法：①体外划痕实验（wound-healing assay），使用ibidi两孔培养插入物创建无细胞区域，定时拍摄并量化迁移面积；②免疫荧光显微镜技术，使用Alexa Fluor 488偶联的抗半乳糖凝集素-3抗体标记细胞表面和外源性半乳糖凝集素-3，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察其分布和摄取；③基于荧光素酶的生物发光细胞活力测定（CellTiter-Glo，CTG），定量ATP水平评估细胞活力。样本来源：DU 145（ATCC HTB-81）和HT-1080（ATCC CCL-121）永生化癌细胞系。

**4. 研究结果**

**4.1 划痕实验**：在DU 145细胞（高内源性半乳糖凝集素-3）中，外源性半乳糖凝集素-3显著抑制迁移，而G(2)和G(3)乳糖功能化树枝状聚合物完全恢复迁移，G(4)和G(6)部分恢复。在HT-1080细胞（低内源性半乳糖凝集素-3）中，半乳糖凝集素-3同样抑制迁移，但树枝状聚合物的恢复效果较弱。对照实验表明，单独添加树枝状聚合物不影响迁移。

**4.2 全长半乳糖凝集素-3与CRD比较**：仅添加CRD（氨基酸112–250）不抑制细胞迁移，与PBS对照无差异；添加乳糖功能化G(6)树枝状聚合物与CRD的组合也未改变迁移，表明NTD对多聚化和细胞锚定至关重要。

**4.3 单体乳糖多价效应**：需2倍于树枝状聚合物中乳糖浓度的单体乳糖（2.54 mM对~1 mM）才能达到类似恢复效果，证实多价相互作用的协同增强效应。

**4.4 荧光成像结果**：免疫荧光显示半乳糖凝集素-3在细胞间形成网状分布，12小时时出现更多点状聚集。添加乳糖功能化G(6)树枝状聚合物后，荧光强度降低约40%，且4°C下内吞抑制实验表明，无树枝状聚合物时约55%的半乳糖凝集素-3被内吞，有聚合物时降至约30%。

**4.5 细胞活力测定**：所有树枝状聚合物和CRD单独处理均无细胞毒性。半乳糖凝集素-3对DU 145细胞的IC50为6.94 μM。当半乳糖凝集素-3与树枝状聚合物联合使用时，细胞活力相对单独半乳糖凝集素-3进一步降低约35%。

**5. 讨论与结论**

讨论部分指出，半乳糖凝集素-3通过NTD介导的多聚化交联细胞表面碳水化合物，从而锚定细胞、抑制迁移。小树枝状聚合物（G(2)、G(3)）在溶液中竞争性结合半乳糖凝集素-3，形成小聚集体，阻止其与细胞表面结合；大树枝状聚合物（G(4)、G(6)）则形成较大的半乳糖凝集素-3/树枝状聚合物簇，部分阻止细胞表面结合，但自身也可能参与部分交联，导致迁移部分恢复。HT-1080细胞因内源性半乳糖凝集素-3低，恢复效果较弱，但仍显著。细胞活力和迁移的平衡需要最佳细胞表面相互作用，过度或不足的交联均降低活力，可能通过失巢凋亡（anoikis）机制。

研究结论：添加半乳糖凝集素-3通过交联细胞抑制迁移并降低活力。乳糖功能化PAMAM树枝状聚合物与半乳糖凝集素-3同时添加时，通过提供竞争性结合位点，减少细胞表面碳水化合物与半乳糖凝集素-3的交联，恢复迁移。但去除过多交联会进一步降低细胞活力。结果表明，细胞表面半乳糖凝集素-3/碳水化合物相互作用在调节细胞迁移中发挥重要作用，与已报道的细胞内半乳糖凝集素-3/蛋白质相互作用共同调控迁移。半乳糖凝集素-3介导的迁移极可能促进癌细胞侵袭和转移，尤其在半乳糖凝集素-3高表达的癌症中，阐明细胞外和细胞内半乳糖凝集素-3/配体相互作用在迁移中的作用至关重要。