《Food Chemistry》：Food-grade phosphorylation enhances calcium binding in salmon peptides: Structural insights and bone health improvement for functional foods
编辑推荐：
•经磷酸化处理的鲑鱼多肽具有很高的钙螯合效率。•通过结构分析与组学研究，发现了其独特的钙结合模式。•磷酸化修饰形成了独特的钙配位环境。•P-CP-Ca螯合物在体内具有更佳的生物利用度及益骨作用。引言钙是人类生理功能所必需的重要矿物质，约占体重的1.5–2.2%。大部分钙以磷酸盐形
- •
经磷酸化处理的鲑鱼多肽具有很高的钙螯合效率。
- •
通过结构分析与组学研究，发现了其独特的钙结合模式。
- •
磷酸化修饰形成了独特的钙配位环境。
- •
P-CP-Ca螯合物在体内具有更佳的生物利用度及益骨作用。
引言
钙是人类生理功能所必需的重要矿物质，约占体重的1.5–2.2%。大部分钙以磷酸盐形式存在于骨骼和牙齿中，其余则以离子形式存在于软组织、细胞及血液中（Wichittra等人，2003）。钙摄入不足会危害健康，导致儿童患佝偻病、老年人患骨质疏松症。长期缺钙还会引发肌肉痉挛、骨质疏松及佝偻病。为维持适宜的钙水平，人们开发了多种补充剂，包括钙盐、有机钙盐以及氨基酸螯合钙。尽管碳酸钙等传统钙补充剂应用广泛，但其生物利用度较低且易引发胃肠道不良反应。
与无机钙相比，有机钙在生物利用度方面更具优势。为克服这些缺陷，源自胶原蛋白多肽的肽钙螯合物因具备更好的溶解性和吸收性而受到关注（Cui等人，2018）。然而，天然胶原蛋白多肽的钙结合能力往往不尽如人意，因其结构限制使得有效的螯合位点较少，因此需要进一步改造以提高其功能（Luo等人，2020）。通过在多肽上引入磷酸基团（-PO32?）的磷酸化修饰为解决这一问题提供了有效途径。这种翻译后修饰能增强多肽的电负性并增加螯合位点，从而强化其与钙离子的结合（Wu等人，2020）。磷酸化多肽可通过形成稳定且可溶的复合物来提升矿物结合能力，这类复合物在肠道环境中不易沉淀。与传统补充剂不同，这类复合物不仅能提高钙的保留率、生物利用度及向骨组织的输送效率，还能减少不良反应。近年来，人们从大豆（Kong等人，2023）、海参卵（Han等人，2024）等来源中分离出了多种具有钙螯合功能的磷酸化多肽。不过，目前对这些多肽与钙离子的结合机制研究尚不多，此外，针对不同来源的钙螯合多肽的全面特性分析以及其在体内促进钙吸收的作用验证仍有待深入研究。
酪蛋白磷酸肽因其独特的磷酸化特征，对胃肠道中的酶解具有更强的抵抗力，因此比未经磷酸化的同类多肽更为稳定。此外，酪蛋白磷酸肽还能通过与钙离子、锌离子、铁离子等二价金属离子结合，提升肠道中矿物质的溶解性和吸收效率（Savastano等人，2019）。磷酸化后的丝氨酸所带负电荷可与矿物质（如钙离子）结合，形成复合物，通过空间位阻或电荷排斥机制保护多肽免受酶解。凭借三个磷丝氨酸基团 followed by两个谷氨酸残基（SpSpSpEE）的结构特征，酪蛋白磷酸肽能够有效结合钙离子和铁离子，防止其在肠道的碱性环境中沉淀，进而提升其溶解性和吸收性。即便被消化成较短的肽段，其N端的疏水区域以及磷酸化基团仍能继续发挥作用，促进钙的吸收（Cruz-Huerta等人，2015）。与钙离子结合的酪蛋白磷酸肽还可通过调节肠道刷状缘膜酶的活性，降低自身的降解速度。
最新研究显示，源自食物的钙螯合多肽正从单纯的体外螯合模型发展为具有更高稳定性、运输效率和生物利用度的功能性钙输送系统（Wu等人，2024）。在此背景下，磷酸化作为一种有效的修饰手段，有助于增强钙的配位能力并提升多肽的生物学性能。与此同时，当前的研究范围已从传统的乳制品来源的磷酸肽扩展到植物和海洋资源衍生的肽钙体系（Lin等人，2024）。
全球渔业产业会产生大量加工废弃物，包括皮肤、鳞片以及骨骼等组织，这些废弃物占鱼类总生物量的50–70%。合理利用这些副产品不仅能带来显著的经济效益，还能减少有机废物处理带来的生态污染风险（Gabriella等人，2020）。作为鲑鱼加工的副产物，鲑鱼骨富含蛋白质，同时也是优质的钙结合多肽来源（Xu等人，2024）。
在本研究中，首先对鲑鱼骨中的胶原蛋白多肽进行酶解处理，随后使用三聚磷酸钠对其实施磷酸化修饰，以提高其钙结合能力。接着，针对肽浓度、温度及反应时间等参数对磷酸化胶原蛋白多肽-钙螯合物的合成条件进行了系统优化。通过FTIR、XRD及荧光光谱等技术对产物进行结构分析，确认了磷酸化及钙螯合反应的成功，并观察到了有助于提升矿物结合能力的结构变化。在钙缺乏的小鼠模型中进行的体内实验表明，补充P-CP-Ca能够有效提升血清钙水平，降低骨吸收标志物（AKP和TRAP）的水平，同时提高骨密度、骨小梁厚度及骨体积分数。此外还研究了骨骼发育相关指标（包括H&E染色和Trap染色）。这些研究结果表明，P-CP-Ca有望成为一种新型的生物功能性钙补充剂，可用于治疗与钙缺乏相关的疾病，并推动益骨功能食品的发展。
章节要点
材料
碱性蛋白酶（200,000?U/g）购自中国南宁的南宁庞博生物工程有限公司。鲑鱼骨来自洛河九林贸易公司，无水乙醇则购自中国天津的天津富玉精细化工有限公司，无水氯化钙购自天津的大茂化学试剂厂，三聚磷酸钠则购自中国的重庆万盛传东化工有限公司。
P-CP-ca螯合物的筛选与制备
为获得尽可能多的P-CP，需通过测定多肽中所含的磷含量来优化肽磷酸化反应的条件。如图1A所示，随着胶原蛋白多肽浓度的升高，多肽中的磷含量先上升而后略有下降，在胶原蛋白多肽浓度为20?mg/mL时达到最大值317.5?mg/100?g。磷酸化反应过程中，三聚磷酸钠作为高效的磷酸基团供体发挥作用。
结论
本研究成功优化了胶原蛋白多肽的磷酸化及钙螯合工艺，得到了具有更强钙结合能力和结构稳定性的P-CP-Ca。磷酸化修饰引入的磷酸基团增强了多肽与钙离子之间的静电相互作用，这一结论得到了FTIR、XRD及荧光光谱分析的支持。补充P-CP-Ca可有效提升血清钙水平，降低骨吸收标志物TRAP的水平，同时提高骨密度。
作者贡献
徐月文负责实验操作并撰写论文初稿。于雪宁、李光、赵思学、王梦涵参与了实验工作。刘晓阳负责研究方案设计并参与论文编辑。周大勇则对研究结果和讨论部分进行了完善，并对论文进行了修改。
CRediT作者贡献说明
徐月文：论文撰写——初稿撰写、实验研究、数据分析、数据整理。于雪宁：数据整理。李光：数据整理。赵思学：数据整理。王梦涵：数据整理。刘晓阳：论文撰写——审阅与编辑、研究指导、资源协调、资金申请、概念构思。周大勇：论文撰写——审阅与编辑。
动物实验相关说明
本研究遵循以下动物福利及报告相关指南开展：欧盟关于用于科学研究的动物保护的2010/63号指令。
本研究已获得大连工业大学动物实验伦理委员会的批准（批准编号：DLPU2024SP020）。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了“中国国家重点研发计划（2023YFD2401502）”以及辽宁省自然科学基金（2025-MS-153）的资助。
徐月文|于雪宁|李光|赵思学|王梦涵|刘晓阳|周大勇
