《Food Chemistry》：Inhibitory mechanism of anthocyanin B-ring substituents on advanced glycation end-product formation through bovine serum albumin binding: Insights from multispectral, molecular docking and proteomics approaches
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•花青素B环的羟基化模式对抑制AGEs起着关键作用。•D3G可通过恢复α-螺旋结构来保护BSA的二级结构。•疏水作用力和氢键有助于稳定花青素与BSA形成的复合物。•蛋白质组学分析表明，D3G能够保护IB、IIA和IIIA亚结构域中的关键残基免受糖基化作用。引言晚期糖基化终产物（A
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花青素B环的羟基化模式对抑制AGEs起着关键作用。
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D3G可通过恢复α-螺旋结构来保护BSA的二级结构。
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疏水作用力和氢键有助于稳定花青素与BSA形成的复合物。
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蛋白质组学分析表明，D3G能够保护IB、IIA和IIIA亚结构域中的关键残基免受糖基化作用。
引言
晚期糖基化终产物（AGEs）是一类通过还原糖与蛋白质的氨基之间的非酶促反应生成的多元化合物，这一反应被称为美拉德反应（Gupta等人，2018年）。虽然这种反应对于食品中理想的风味、香气和颜色的形成至关重要，但过度的糖基化会导致不良风味以及有害的褐变，从而降低食品质量（Li等人，2024年）。除了感官品质下降之外，美拉德反应还会导致AGEs的积累——这类强效的促炎物质与多种慢性疾病的发病机制有关，包括糖尿病、心血管疾病和阿尔茨海默病（Hirai等人，2023年；Ying等人，2021年；Zheng等人，2022年）。AGEs的形成是一个复杂的化学转化过程。最初，羰基团与蛋白质氨基发生缩合反应，生成不稳定的席夫碱，这些席夫碱随后环化形成N-取代的糖胺，并进一步重排形成阿马多里产物。这些中间体随后会发生氧化降解和断裂，产生高度活性的α-二羰基化合物，最典型的有甲基乙二醛（MGO）、乙二醛（GO）和3-脱氧葡萄糖酮（3-DG）。这些强效的亲电物质会与蛋白质中的亲核残基——主要是赖氨酸的ε-氨基、精氨酸的胍基以及半胱氨酸的巯基——发生交联，最终形成多种稳定的、不可逆的AGEs（Sergi等人，2021年）。因此，在食品加工过程中抑制AGEs的形成是提升食品安全性和保护公众健康的重要策略。正因如此，人们越来越关注寻找天然的生物活性抑制剂，作为比氨基胍这类合成抑制剂更有效且更安全的替代品，因为后者往往存在潜在的副作用（Lee等人，2022年；Sarmah & Roy，2022年）。
大量证据表明，天然浆果多酚提取物能够在体内有效抑制AGEs的形成，其效果与花青素含量密切相关（Hanamura等人，2005年；Tan等人，2023年）。花青素由花青素苷元和糖分子组成，其结构特征为2-苯基苯并吡喃阳离子骨架（flavylium骨架）（Houghton等人，2021年）。先前的研究已经证明，某些特定的花青素，如花青素-3-O-葡萄糖苷，可以通过多种机制抑制AGEs的形成。这些机制包括清除自由基、捕获α-二羰基化合物形成单加合物和双加合物，以及减少蛋白质的交联和聚集（Chen等人，2014年；Ferreira等人，2022年；Zhang等人，2021年）。牛血清白蛋白（BSA）是一种常见的球状蛋白，由于含有大量易发生糖基化的赖氨酸和精氨酸残基，因此常被用作模型水胶体（Zhao, Huang等人，2022年）。我们之前的研究已经发现，蓝莓花青素能与BSA形成稳定的复合物，且在加工过程中仍能保持稳定性（Lang等人，2019年；Zang等人，2022年；Zhang等人，2024年）。人们推测，这种较高的结合亲和力正是它们能够抑制BSA非酶促糖基化的根本原因（Liao等人，2024年）。
此外，结构-活性关系研究也表明，花青素在抑制乳清蛋白和β-乳球蛋白系统中的荧光AGEs方面的效果，会受到分子量以及糖基取代类型的影响（Khalifa等人，2018年；Wang等人，2021年）。尤其重要的是，B环上羟基和甲氧基的数量与位置决定了花青素的生物活性（Jing等人，2014年）。 Pelargonidin-3-O-葡萄糖苷（P3G）、花青素-3-O-葡萄糖苷（C3G）、malvidin-3-O-葡萄糖苷（M3G）和delphinidin-3-O-葡萄糖苷（D3G）都是常见的浆果花青素，它们之间的主要差异在于B环的取代模式（Domitrovic，2011年）。尽管多酚已被认为具有抗糖基化作用，但关于B环羟基化及其对蛋白质结构的特异性保护作用的结构-活性关系仍然不太清楚。虽然已经观察到了整体的抑制作用，但很少有研究将多模型糖基化动力学与蛋白质组学及分子动力学模拟相结合，来确定这些生物活性分子具体保护了哪些残基。
本研究旨在通过评估四种结构不同的花青素（P3G、C3G、M3G和D3G）来填补这一空白。我们采用了多光谱分析、分子动力学模拟以及LC-MS/MS蛋白质组学技术，阐明了B环取代基如何决定其与BSA亚结构域的结合亲和力，进而抑制AGEs的形成。这些研究结果为设计具有靶向抗糖基化特性的功能性食品成分提供了分子层面的理论依据。
章节节选
化学品与试剂
纯度大于96%的BSA购自北京鼎国长盛生物技术有限公司（中国北京）。d-果糖、MGO（40% v/v）、GO（40% v/v）、氯化钠和氯化钾购自麦克林科技有限公司（中国北京）。氨基胍购自上海碧德医药科技有限公司（中国上海）。纯度大于98%的P3G、C3G、M3G和D3G购自武汉天智生物技术有限公司（中国武汉）。二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺
不同B环花青素对AGEs形成的影响
AGEs是通过一系列复杂的反应生成的，包括重排、氧化、脱水以及环化反应（Sergi等人，2021年）。为了系统地评估四种花青素（P3G、C3G、M3G和D3G）对AGEs形成的阶段特异性抑制作用，我们采用了三种反应模型（BSA-果糖、BSA-MGO和BSA-GO）。如图1所示，所有浓度在100到400?μM之间的花青素在所有模型中都表现出剂量依赖性的抑制作用，且抑制效果十分显著
结论
本研究通过BSA-果糖/MGO/GO糖基化模型，评估了四种具有不同B环取代基的花青素（P3G、C3G、M3G和D3G）对AGEs形成的抑制作用。在所测试的化合物中，D3G的AGEs形成抑制作用最强，其次是M3G、C3G和P3G，这表明B环羟基化程度的增加会显著提升抑制效果。荧光光谱分析结果显示，这些花青素与BSA之间的相互作用是
CRediT作者贡献说明
张宇：写作——初稿撰写、验证、方法学研究、数据整理。丁阳：写作——初稿撰写、验证、方法学研究、数据整理。郑克新：验证、方法学研究。赵兰琼：验证、方法学研究。郎玉玺：验证、方法学研究。王玉珠：数据整理。陈玉欣：数据整理。徐昊：写作——审阅与编辑。王明月：验证、方法学研究。杨宝茹：监督工作。清水邦义：监督工作。李斌：监督工作、资源提供。谭辉：
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究报告得到了“By-Health营养研究基金（编号：TY202101071）”以及“中国国家自然科学基金（NSFC）（编号：32502265）”的支持。
张宇|丁阳|郑克新|赵兰琼|郎玉玺|王玉珠|陈玉欣|徐昊|王明月|杨宝茹|清水邦义|李斌|谭辉
