GREACE基因提高了酿酒酵母中有机酸和氨基酸的积累，及其在提升酱油的醇厚感和鲜味方面的应用

《International Journal of Gastronomy and Food Science》：Improved accumulation of organic acids and amino acids in Saccharomyces cerevisiae by GREACE and its application in enhancement of kokumi and umami in soy sauce

　　摘要：本研究旨在通过基因组复制工程辅助的连续进化技术结合高盐度筛选，提高酿酒酵母中有机酸和氨基酸的含量，以此提升酱油的醇厚感和鲜味。经过优化后的G1.6-15菌株的琥珀酸浓度、氨基酸氮含量以及总酸度分别达到620.1毫克/升、13.56毫克/克和281.3毫克/克，相比亲本菌株G100分别高出146.1%、47.2%和57.4%。在5升发酵罐中进行60小时的补料发酵后，该菌株的生物量及琥珀酸产量分别为57.8克/升和9.6克/升。将其制成复合发酵风味增强剂后，CFE-G1.6-15中的总游离氨基酸和琥珀酸浓度分别为85.35毫克/克和145毫克/克，相比CFE-G100分别高出36.4%和520%。在酱油中应用时，即使在相同添加量下，CFE-G1.6-15的增味效果也优于纯琥珀酸，且有机酸与氨基酸之间存在协同作用。该菌株显著提升了酱油的鲜味、醇厚感与甜度，降低了咸味感知，并增加了挥发性风味物质的含量。进一步分析表明，CFE中的细胞外有机酸，尤其是琥珀酸，对提升醇厚感起着关键作用，而氨基酸则主要贡献于鲜味和甜度的提升。本研究为制备高效且符合工业要求的优质风味增强剂、改善酱油风味提供了非转基因的技术路径。

引言：酱油作为一种历史悠久的传统调味品，在亚洲乃至全球范围内被广泛使用（Sassi等人，2021）。由于其独特的风味和丰富的营养价值，酱油已成为人们日常饮食中不可或缺的成分。酱油的风味十分复杂，主要由咸味、鲜味、甜味以及浓郁的酱香构成（Diez-Simon等人，2020）。近年来，随着消费者对更复杂风味的追求，酱油的鲜味和醇厚感逐渐成为调味品领域的研究重点（Ramesh、Venkatappa和Bhat，2025）。鲜味是酱油的核心风味，它能凸显酱油的香气，提升整体口感，并激发食材本身的风味（Lioe、Selamat和Yasuda，2010）。而醇厚感则是一种能够提升味道的丰富度、连贯性及饱满感的特性，为整体风味增添深度与和谐感（Ramesh、Venkatappa和Bhat，2025）。与甜味或咸味等基本味觉不同，醇厚感并非一种基本味觉，而是一种调节性的感觉。它可以通过激活味细胞中表达的钙感应受体来增强其他基本味觉，尤其是鲜味、甜味和咸味（Kitajima、Goda和Kuroda，2026）。许多化合物，如谷胱甘肽、γ-谷氨酰肽以及某些有机酸，因具有钙感应受体激活作用而被认为具有提升醇厚感的功能（Li、Zhang和Lametsch，2022）。因此，提升酱油的鲜味和醇厚感是其提升整体风味品质及吸引消费者的重要策略。现有研究表明，除了含谷氨酸的寡肽之外，多种代谢物也能影响酱油的鲜味和醇厚感。在提升鲜味方面，核苷酸（如5′-GMP和5′-IMP）以及游离氨基酸（如谷氨酸）被认为是重要因素（Zhang等人，2017）。而有机酸则在提升醇厚感方面起着关键作用（Ramesh、Venkatappa和Bhat，2025）。在各种具有提升醇厚感功能的物质中，琥珀酸因其能在酱油中显著提升醇厚感，以及作为酵母核心碳代谢途径中的关键中间体而备受关注（Kitajima等人，2025）。虽然较高浓度的琥珀酸会带来轻微的酸味，但在发酵产品中通常存在的浓度下，它的主要作用是通过与氨基酸和核苷酸的协同作用来提升鲜味和醇厚感，而非形成明显的酸味（Hwang和Kim，2026；Huang等人，2024）。在酿酒酵母的代谢过程中，三羧酸循环是连接碳代谢与氮同化的核心环节。α-酮戊二酸和草酰乙酸等中间体是氨基酸生物合成的直接前体，而三羧酸循环通量的增加往往伴随着有机酸和氨基酸产量的上升（Chu等人，2024）。这种代谢关联为利用琥珀酸的积累作为筛选具有更强风味前体代谢能力的菌株的指标提供了依据。因此，尽管知道醇厚感的形成涉及多种钙感应受体活性化合物，而不仅仅是琥珀酸，但鉴于其代谢重要性、已知的醇厚感提升作用以及与氨基酸生成的相关性，本研究仍选择琥珀酸作为主要的筛选标准。此外，琥珀酸易于定量，非常适合用于高通量筛选通过GREACE技术产生的有益突变体。

传统酵母提取物是从食品级酵母，如酿酒酵母，通过酶解或自溶方式得到的天然调味基础材料（Tao等人，2023）。酵母提取物通常富含氨基酸、肽类、核苷酸和有机酸，被广泛用于发酵调味品中，以提升鲜味、增加风味丰富度并优化整体风味协调性（Tomé，2021）。在酱油中添加酵母提取物可显著提高其氨基酸氮含量并丰富风味层次（Zhou等人，2022）。然而，传统酵母提取物的制备过程通常会丢弃含有大量细胞外代谢物的发酵上清液（Tao等人，2023）。而这些细胞外代谢物中的有机酸，如琥珀酸，正是提升酱油醇厚感的关键因素。为了充分利用细胞内和细胞外的风味活性成分，人们更倾向于使用复合风味增强剂，即将发酵上清液与水解后的酵母细胞生物质结合在一起。这样的复合风味增强剂不仅能保留细胞外的有机酸（尤其是琥珀酸），还能包含细胞内的氨基酸、肽类和核苷酸，从而提供比传统酵母提取物更为全面的风味体验。值得注意的是，酵母衍生产品中天然存在的氨基酸、有机酸和RNA可直接参与鲜味和醇厚感的形成。有机酸（尤其是琥珀酸）是酿酒酵母三羧酸循环中的关键中间体，其积累水平与酵母菌株的代谢调控密切相关（Yoshida和Yokoyama，2012）。近年来，研究人员通过基因工程改造酵母的代谢网络，成功培育出了具有更高能力生产多种有机酸和氨基酸的工程菌株。例如，某些菌株的琥珀酸产量甚至可超过60克/升（Xie等人，2024）。但由于许多国家和地区对转基因微生物及其产品在食品中的使用有严格的监管限制（Hanlon和Sewalt，2021），再加上消费者对其接受度的顾虑，将基因工程菌株应用于酱油生产面临着诸多挑战。相比之下，通过传统诱变育种获得的酿酒酵母由于不属于转基因菌株，因此在符合食品监管要求及获得消费者认可方面具有明显优势（Parapouli等人，2020）。基因组复制工程辅助的连续进化技术是一种利用工程化的DNA复制系统在基因组复制过程中引入突变，从而在活细胞内实现目标基因或代谢途径的持续定向进化的策略（Wang等人，2023）。该技术无需外部诱变剂，能够在选择压力下实现快速、长期的适应性进化。在之前的研究中，我们构建了一种名为YEP352-PAK-POL3-01/L612M的突变质粒，其中含有POL3基因的突变版本，该基因编码的DNA聚合酶δ的校对功能及复制精确度存在缺陷。我们已系统研究了这种突变因子在酿酒酵母中的诱变效率（Xu等人，2018）。通过5-氟尿嘧啶抗性试验发现，携带POL3-01/L612M突变的酿酒酵母的突变频率是野生型菌株的237倍。对进化后菌株的全基因组测序显示，其基因组发生了多种改变，包括8072个单核苷酸多态性以及1457次插入/缺失事件，这表明该突变系统能够有效产生足够的遗传多样性，支持适应性进化。GREACE技术也曾被成功用于提升啤酒酵母对头孢他辛的耐受性并减少乙醛的产生（Xu等人，2019；Park和Kim，2021）。此外，GREACE技术的另一个优点是，一旦达到预期的进化目标，就可以彻底去除突变质粒（Xu等人，2018）。这样一来，选择标记就会消失，同时由于缺乏启动子、终止子以及关键的突变基因，最终得到的进化菌株将不含有任何外源遗传元素，因而属于非转基因菌株，符合那些限制转基因生物使用的食品监管规定（Hanlon和Sewalt，2021）。另外，尽管GREACE技术在进化过程中会引入随机基因组点突变，但这些突变在机制上与传统的诱变育种技术（如紫外线照射或化学诱变剂）产生的突变类似，而后者在工业酵母菌株开发中已有长期的安全应用历史。在工业应用中，这类随机突变菌株的稳定性通常需要通过多代传代稳定性测试来验证，以确保与其生产相关的表型在后续世代中保持稳定。因此，通过适当的表型筛选和稳定性验证，GREACE技术培育的菌株在生产可靠性和符合监管要求方面，与传统培育的工业酵母并无太大差异。此外，由于琥珀酸是影响酱油醇厚感的关键风味物质，且其含量与产品中的有机酸和氨基酸含量高度相关（Chu等人，2024），同时琥珀酸还是酿酒酵母中三羧酸循环活动与氨基酸生物合成之间的代谢纽带。三羧酸循环作为连接碳代谢与氮同化的核心环节，其中间体如α-酮戊二酸和草酰乙酸是氨基酸生物合成的直接前体，而谷氨酸和γ-氨基丁酸等氨基酸则能影响琥珀酸的生成。因此，三羧酸循环通量的增加，表现为琥珀酸积累的增加，往往伴随着氨基酸代谢模式的变化，这使得琥珀酸成为一种非常实用的筛选指标。利用这类经过优化的菌株来制备富含有机酸和氨基酸的复合风味增强剂，再将其应用于酱油配方中，不仅可以规避基因工程带来的应用限制，还能提供一种更为实用的技术途径来提升酱油的鲜味和醇厚感。

在本研究中，首先利用GREACE技术结合以琥珀酸为关键指标的高盐度筛选，提高了酿酒酵母G100中的氨基酸和有机酸含量。之后，在5升发酵罐中对优化后的菌株进行补料发酵，并对复合风味增强剂的成分进行了分析。最后，评估了该复合风味增强剂在提升酱油醇厚感与鲜味方面的效果，并探讨了其背后的作用机制。本研究的结果将为开发安全、高效且符合监管要求的酱油风味增强剂提供理论基础和技术参考，这类增强剂在工业应用方面具有巨大潜力。

片段摘录：酵母与培养基：我们实验室保存有用于葡萄酒发酵的酿酒酵母G100。质粒YEP352-PAK-POL3/01/L612M是在之前的研究中被构建并保存下来的（Xu等人，2018）。培养酿酒酵母时使用的是YPD培养基，其组成包括10克/升酵母提取物、20克/升蛋白胨、20克/升葡萄糖，必要时还可添加20克/升琼脂，培养条件为30摄氏度、200转/分钟，培养时间为24小时。用于筛选的培养基则包含20克/升葡萄糖、10克/升酵母提取物、20克/升蛋白胨、1-1.8摩尔/升的NaCl以及0.2克/升的G418，用以创造高盐环境。

通过GREACE技术培育出氨基酸和有机酸含量更高的改良酵母：GREACE技术在酵母工程中的应用优势在于它将连续诱变与筛选相结合，从而能够高效地积累有益的遗传变异，进而实现目标性且稳定的性状改良（Xu等人，2018）。本研究中所采用的GREACE技术通过突变质粒使突变频率提高237倍，同时在多个染色体上引发全基因组范围的突变，由此能够促进……

结论：通过结合梯度高盐度筛选的GREACE技术，我们最终获得了经过质粒消除处理、属于非转基因型的酿酒酵母G1.6-15，该菌株的有机酸和风味氨基酸产量得到了提升。在5升生物反应器中通过分批发酵，G1.6-15菌株的生物量达到了57.8克/升，琥珀酸浓度为9.6克/升。由此得到的CFE-G1.6-15相较于CFE-G100具有更优异的成分特性，其总游离氨基酸含量高出36.4%。作者声明没有利益冲突。作者贡献说明： Qi Li：监督、项目管理、资金获取；Chunfeng Liu：数据可视化、资源提供；Chengtuo Niu：文章撰写与编辑、资金获取、概念设计；Ruiqi Xu：定量分析；Yaxin Wang：初稿撰写、定量分析。未引用的参考文献：Li等人，2022年。利益冲突声明：? 作者声明不存在可能影响本文研究结果的任何已知财务利益或个人关系。致谢：本研究得到了中国国家自然科学基金（编号32272282和32472294）的资助。Chengtuo Niu|Yaxin Wang|Ruiqi Xu|Chunfeng Liu|Qi Li，中国无锡214122，江南大学生物技术学院，教育部工业生物技术重点实验室。