鉴定一种新型酵母源肽作为AT1R的正向变构调节剂

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Identification of a novel yeast-derived peptide as positive allosteric modulator of AT1R

　　

天然产物是针对G蛋白偶联受体（GPCRs）药物发现的重要来源。其中，生物活性肽因其高选择性和低毒性而成为有前景的治疗候选物。在本研究中，研究人员探究了来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的肽对血管紧张素II（AngII）1型受体（AT1R）的调节作用，AT1R是一种在心血管稳态中起核心作用的A类GPCR。研究人员鉴定了一种七肽TLPPPPL（TLP），该肽能增强AngII与AT1R的结合而不改变最大结合能力，这是通过基于HTRF的配体结合测定确定的。使用基于BRET的生物传感器的功能分析表明，TLP作为正向变构调节剂，增强了G蛋白激活和β-arrestin募集。此外，TLP增强了由偏向性AT1R激动剂诱导的信号，并挽救了疾病相关AT1R突变体的受损功能，表明其对激动剂驱动的受体激活具有广泛的正向调节作用。总之，这些发现鉴定了一种酵母源性的AT1R正向变构调节剂，并强调了天然肽作为开发靶向GPCR治疗药物的有前景先导物的潜力。

G蛋白偶联受体（GPCRs）是调控生理过程的关键药物靶点，已批准药物中靶向GPCRs的比例最高。天然产物是药物发现的重要来源，其中肽类相比小分子具有更高的靶点选择性和更低的毒性，且代谢清除快，减少长期副作用。酵母是生物活性肽的潜在来源，已有研究显示酵母提取物具有降压、抗氧化等作用，但针对血管紧张素II（AngII）1型受体（AT1R）的肽类变构调节剂尚未充分开发。AT1R是A类GPCR，在心血管稳态中起核心作用，通过激活G_q/11蛋白和β-arrestin通路调控血压。现有药物包括AngII（用于血管舒张性休克）和AT1R阻断剂（ARBs，如氯沙坦），但变构调节策略可提供更精细的调控。本研究旨在从酿酒酵母酶解产物中筛选靶向AT1R的肽类正向变构调节剂（PAM），以发掘天然肽在GPCR靶向治疗中的潜力。

研究人员通过酶解酵母蛋白制备肽库，经超滤分级、功能筛选，结合LC-MS/MS鉴定和分子对接模拟，最终筛选出六肽，其中七肽TLPPPPL（TLP）表现出最强的正向变构调节活性。利用BRET生物传感器检测G蛋白解离和β-arrestin募集，HTRF配体结合实验评估结合亲和力，并通过定点突变构建疾病相关AT1R突变体，评估TLP的挽救作用。主要技术方法包括：酶解制备肽库、超滤分级、LC-MS/MS肽鉴定、分子对接模拟、BRET生物传感器（检测G蛋白G_q/G_i3解离和β-arrestin_1/2募集）、HTRF配体结合实验、定点突变技术、ELISA检测表达、IP1积累和ERK磷酸化测定。样本来源为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），无患者队列。

研究结果分为六个部分：

**3.1 从酵母提取物中鉴定靶向AT1R的肽**：通过超滤分级获得P2组分，BRET检测显示P2.5亚组分显著增强AngII诱导的G_q解离和β-arrestin₁募集，且无内在活性。LC-MS/MS鉴定出32种肽，分子对接按结合能排序，筛选出6个候选肽，其中TLP在G蛋白和β-arrestin通路中增强效果最强。

**3.2 TLP作为AT1R的正向变构调节剂（PAM）**：TLP单独不激活G_q、G_i3、β-arrestin_1/2，也不诱导IP1积累或ERK磷酸化。与AngII共处理时，TLP浓度依赖地增强上述信号，使AngII剂量-反应曲线左移（pEC50升高），不改变最大效应，符合纯PAM特征。实时BRET动力学显示TLP延长G_q信号持续时间，序贯添加实验确认TLP预孵育不影响其增强作用。

**3.3 TLP增强AT1R偏向性激动剂的效力**：TLP显著增强G蛋白偏向性激动剂TRV056诱导的G_q和G_i3解离，以及β-arrestin偏向性激动剂TRV027诱导的β-arrestin_1/2募集，但对AngIII、TRV055、TRV026的增强作用有限，表明TLP对特定偏向性激动剂具有选择性增强效应。

**3.4 TLP是AT1R的选择性PAM**：AT1R拮抗剂坎地沙坦完全阻断TLP对AngII信号的增强作用，证明其作用依赖于AT1R。TLP对APJ、M1R、H1R、mGlu2四种GPCR的G蛋白激活无显著影响，表明其对AT1R具有高度选择性。

**3.5 TLP增强AngII与AT1R的结合亲和力**：HTRF配体结合实验显示，TLP降低AngII-Red的结合平衡解离常数（Kd）而不改变最大结合容量（Bmax），且呈浓度依赖增强。分子对接预测TLP结合于AT1R胞外区域，与受体N端和跨膜螺旋7（TM7）相互作用，可能通过改变AngII C端Phe8侧链取向来增强结合。

**3.6 TLP挽救自然AT1R突变体的受损信号**：TLP完全恢复T282M突变体（与肾小管发育不全相关）的G_q信号至野生型水平，并增强C289W突变体的β-arrestin₁募集部分恢复I103T和I103T/A244S突变体（与房颤相关）的β-arrestin₁效力。TLP还促进野生型和突变型AT1R的激动剂依赖性内吞及早期内体转运。

讨论部分总结了TLP与已知AT1R变构调节剂（如LVV-Hemorphin-7、同型半胱氨酸等）的差异：TLP是纯PAM，无内在活性，增强AngII结合亲和力，不改变最大效应，维持正常脱敏，促进内化。其作用机制可能涉及稳定受体N端与AngII的相互作用网络。未来需通过冷冻电镜等结构生物学方法确定TLP的结合位点。TLP来源于酵母SEC24蛋白，易于化学修饰，为优化药理特性提供了可能。

**研究结论**：总之，研究人员从酵母中鉴定了一种新型短肽，命名为TLP。该七肽作为AT1R的正向变构调节剂（PAM）。此外，TLP不仅增强了AT1R偏向性激动剂的信号，还挽救了疾病相关AT1R突变体的功能。这些发现凸显了挖掘天然肽用于药物发现的潜力，并为开发针对AT1R相关病理的个性化治疗策略铺平了道路。