CCL7-CCR3信号介导过敏性鼻炎小鼠模型中的嗅觉功能障碍

《Frontiers in Immunology》：CCL7-CCR3 signaling mediates olfactory dysfunction in a mouse model of allergic rhinitis

　　

**摘要**

**背景：** 过敏性鼻炎（AR）是一种常见的慢性上气道炎症性疾病。AR患者的嗅觉功能障碍（OD）是一种常见且负担沉重的并发症，显著损害生活质量。虽然AR相关OD的发病机制尚未完全阐明，但新出现的证据表明嗅球（OB）小胶质细胞神经炎症是关键促成因素。C-C基序趋化因子配体7（CCL7）在AR鼻黏膜中持续上调，并已被证实可驱动小胶质细胞炎症。然而，其在OB小胶质细胞中的表达和功能仍未明确。本研究旨在探讨CCL7在OB小胶质细胞中的具体作用及其对AR相关OD的潜在贡献，以提供新的机制见解和潜在干预靶点。

**方法：** 建立并通过对OVA诱导的鼠AR相关OD模型进行行为学、血清学和组织病理学分析验证。通过qPCR、ELISA和免疫荧光与小胶质细胞标志物的共定位评估OB和鼻黏膜中CCL7和C-C趋化因子受体3型（CCR3）的表达谱。使用Bindarit在持续干预期间评估鼻内CCL7抑制的治疗效果。通过在初始小鼠中鼻内给予外源性CCL7，以及向已建立OD的AR小鼠OB立体定向注射CCR3特异性拮抗剂SB-328437，进一步验证了CCL7-CCR3轴的特异性。体外研究采用过敏原刺激的鼻上皮细胞与小胶质细胞共培养，并联合或不联合CCR3拮抗剂预处理。

**结果：** 在AR相关OD小鼠的OB中，CCL7表达显著升高，并与OD的行为学指标呈正相关。在该模型中，CCR3是OB中唯一显著上调的CCL7受体，选择性定位于活化的小胶质细胞。鼻内给予Bindarit逐渐改善AR小鼠的嗅觉功能，在治疗第8周首次观察到显著改善，同时OB中CCL7和神经炎症介质减少。相反，在初始小鼠中鼻内给予外源性CCL7可重现OD并上调这些神经炎症标志物。此外，在OB中使用SB-328437进行CCR3特异性拮抗可部分恢复已建立OD的AR小鼠的嗅觉功能。体外实验中，过敏原刺激的鼻上皮细胞分泌CCL7，通过CCR3激活小胶质细胞，该效应可被CCR3拮抗剂部分逆转。

**结论：** CCL7-CCR3信号轴将鼻过敏性炎症与OB小胶质细胞神经炎症及随之而来的AR相关OD联系起来，为AR相关OD确定了一个有前景的治疗靶点。

**论文解读：CCL7-CCR3信号轴介导过敏性鼻炎相关嗅觉功能障碍的机制研究**

**一、研究背景与科学问题**

过敏性鼻炎（allergic rhinitis, AR）作为一种高度流行的慢性上气道炎症性疾病，全球约10%–40%的人口受其影响。嗅觉功能障碍（olfactory dysfunction, OD）是AR患者中一种常见且负担沉重的并发症，发生率最高可达42.9%，在合并慢性鼻窦炎和鼻息肉的患者中甚至高达88%。OD显著损害患者生活质量，常伴随焦虑、抑郁、认知缺陷和睡眠障碍，并进一步加重社会经济负担。然而，AR相关OD的发病机制至今尚未完全阐明，针对其预防和逆转的治疗策略仍然有限。传统观点将OD归因于机械性鼻阻塞，但鼻气流与嗅觉敏锐度之间的分离现象，以及减充血剂无效而抗炎干预有效的事实，均有力表明AR病理生理中固有的免疫炎症机制是OD发生的主要驱动因素。近年来研究提示，嗅球（olfactory bulb, OB）小胶质细胞介导的神经炎症在AR相关OD中发挥关键作用。C-C基序趋化因子配体7（C-C motif chemokine ligand 7, CCL7），又称单核细胞趋化蛋白-3（monocyte chemoattractant protein-3, MCP-3），在AR鼻黏膜中持续上调，已被证实可驱动小胶质细胞炎症。然而，CCL7在OB小胶质细胞中的表达及其是否参与AR相关OD的发病，此前尚无明确报道。基于此，研究人员提出假说：CCL7在OB小胶质细胞中表达，并作为连接鼻黏膜过敏性炎症与OB神经炎症及OD的重要介质，本研究旨在验证该假说并阐明其具体机制。

**二、主要技术方法**

本研究采用多种技术手段：①建立卵清蛋白（ovalbumin, OVA）诱导的鼠AR相关OD模型，通过行为学测试（埋藏食物颗粒测试，buried food pellet test, BFPT）、血清学检测（ELISA检测IgE、IL-4、IL-5）和组织病理学分析（H&E和PAS染色）进行验证；②使用实时荧光定量PCR（qPCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测CCL7及其受体在OB和鼻黏膜中的表达；③采用免疫荧光染色（CR3与IBA-1、TMEM119共染）确定CCR3在OB中的细胞定位；④药理学干预包括鼻内给予CCL7抑制剂Bindarit（从AR模型维持期开始，隔日一次，持续16周）、鼻内给予外源性CCL7（100 ng/次）以及立体定向注射CCR3特异性拮抗剂SB-328437进入OB；⑤体外实验采用人鼻上皮细胞（HNEpC）与人小胶质细胞克隆3（HMC3）共培养体系，以尘螨变应原Der p 1刺激鼻上皮细胞制备条件培养基（conditioned medium, CM），并联合CCR3拮抗剂预处理验证信号通路特异性。研究使用了C57BL/6小鼠（6–8周龄）和商业化细胞系。

**三、研究结果**

**3.1 AR小鼠表现出OD**

通过12周OVA致敏和激发成功建立AR小鼠模型，表现为鼻抓挠频率显著增加、血清IgE/IL-4/IL-5水平显著升高、鼻黏膜嗜酸性粒细胞浸润增多和杯状细胞增生。BFPT显示AR小鼠通过嗅觉定位食物的潜伏期显著延长，而视觉辅助定位无差异，证实AR小鼠存在可量化的嗅觉功能损害。

**3.2 AR相关OD小鼠OB中CCL7表达升高并与嗅觉功能改变相关**

通过qPCR筛查OB中多种趋化因子的表达，发现CCL7是唯一显著升高的趋化因子，ELISA进一步证实其蛋白水平升高。相关分析显示CCL7的mRNA和蛋白表达水平均与BFPT潜伏期呈正相关（r = 0.8996和r = 0.8437），提示OB中CCL7升高与嗅觉功能障碍相关。鼻黏膜中也检测到一致的CCL7升高。

**3.3 CCR3是AR相关OD小鼠OB中唯一上调的CCL7受体，且表达定位于小胶质细胞**

对CCL7的已知受体CCR1、CCR2、CCR3和CCR5进行qPCR检测，发现仅CCR3在AR相关OD组OB中显著上调，ELISA证实蛋白水平升高。免疫荧光共染显示CCR3与经典小胶质细胞标志物IBA-1和TMEM119共定位，荧光强度分布分析确认了空间重叠，表明CCR3特异性表达于OB小胶质细胞。

**3.4 CCL7-CCR3是AR相关OD小鼠OD和OB神经炎症的重要介质**

鼻内给予CCL7抑制剂Bindarit后，AR小鼠嗅觉功能呈时间依赖性恢复，治疗第8周起出现显著改善。Bindarit治疗显著下调鼻黏膜和OB中CCL7表达，并减少OB中神经炎症标志物IL-1β、IL-6和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）的表达。在初始小鼠中鼻内给予外源性CCL7可诱导嗅觉功能障碍并上调上述神经炎症标志物。向已建立OD的AR小鼠OB立体定向注射CCR3拮抗剂SB-328437可显著改善嗅觉功能并降低OB中CCR3蛋白水平。

**3.5 体外实验证实上皮来源的CCL7通过CCR3依赖方式促进小胶质细胞炎症活化**

Der p 1刺激HNEpC后，屏障功能标志物Claudin-1和连接黏附分子（junctional adhesion molecule, JAM）表达下调，AR相关炎症介质IL-4、IL-5、IL-1β、IL-6及CCL7表达上调。ELISA证实CM中CCL7蛋白水平显著升高。HMC3细胞经CM培养后，神经炎症标志物IL-1β、IL-6和iNOS表达显著上调，而CCR3拮抗剂SB-328437预处理可显著抑制这些炎症标志物的表达。

**四、讨论与结论**

本研究首次阐明CCL7-CCR3信号轴在AR相关OD中的关键作用，建立了从鼻黏膜过敏性炎症到OB小胶质细胞神经炎症的“鼻-脑”炎症信号传导通路。研究证实CCL7在AR小鼠OB中显著上调，其受体CCR3选择性表达于活化的小胶质细胞。通过CCL7抑制剂、外源性CCL7给药和CCR3特异性拮抗等多重药理学证据，验证了该信号轴的特异性。值得注意的是，Bindarit治疗虽显著改善嗅觉功能和OB神经炎症，但鼻抓挠行为无显著差异，提示CCL7-CCR3抑制可缓解神经炎症和恢复嗅觉功能，但不直接缓解已建立AR的瘙痒症状，可能因为行为症状受CCL7以外的多条通路调控。研究存在以下局限性：缺乏基因验证（OB小胶质细胞特异性CCR3条件敲除小鼠尚不可得）；未进行体内直接示踪上皮来源CCL7向OB的转运；CM方法不能排除其他炎症分子的贡献；临床转化验证不足。未来研究方向包括：阐明CCL7下游胞内信号通路（如NLRP3炎症小体和IL-1β通路）及其与已鉴定的IL-6、P2X7R通路之间的相互关系；确定最佳干预时间窗；开发CCL7或CCR3靶向单克隆抗体用于鼻内递送。

**结论：** 本研究确定了CCL7-CCR3信号轴是将鼻过敏性炎症与OB神经炎症及OD联系起来的重要机制，推进了对AR病理生理学的理解，将CCL7-CCR3轴确定为一个新的治疗靶点。鉴于AR相关OD的显著临床负担和当前治疗的不足，针对该轴的特异性调控为AR相关OD提供了潜在的治疗途径，具有可观的转化前景。