利用纳米粒子驱动的表型组到基因组检测技术实现快速无PCR检测少菌量分枝杆菌

《Journal of Biological Engineering》：Rapid PCR-free detection of paucibacillary mycobacteria using nanoparticle-enabled phenomics-to-genomic biosensing assay

　　

摘要

背景

结核病仍然是全球主要的健康问题，每年导致约140万人死亡，且对中低收入国家的影响尤为严重。尽管诊断技术有所进步，但在资源匮乏的地区，快速且经济实惠的结核病检测方法仍然有限。基于培养的方法虽然灵敏度很高，但需要较长的培养时间；而痰涂片显微镜检查虽然应用广泛，但其灵敏度较低，尤其是在细菌负荷较低时。像GeneXpert这样的分子检测方法虽然灵敏度更高，但成本高昂且依赖特定基础设施，因此难以在结核病高发地区普及。本研究开发了一种快速、分步且低成本的诊断流程，该流程结合了用于分离和富集分枝杆菌的糖基化磁性纳米颗粒与基于金纳米颗粒的等离子体生物传感器，以实现分子层面的特异性检测。

方法

以经验证的生物安全等级1替代菌株——耻垢分枝杆菌作为结核分枝杆菌的替代菌，优化了糖基化磁性纳米颗粒，用于从液体悬浮液中捕获并富集分枝杆菌，随后进行齐尔-尼elsen染色观察。在经过磁性富集和DNA提取后，使用针对IS6110的结核病探针以及针对耻垢分枝杆菌的特异性探针进行等离子体生物传感检测。通过吸光度比值测量、系列DNA稀释实验，以及与铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、链球菌属、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等非分枝杆菌呼吸道病原体的比较，评估了该方法的分析灵敏度和选择性。

结果

磁性富集显著提高了细菌的回收率，扩展了检测范围，使得最低浓度为102 CFU/mL的抗酸杆菌也能被检测到，而传统涂片显微镜则无法检测到如此低浓度的细菌。该等离子体生物传感器无需PCR扩增即可将分枝杆菌样本与非分枝杆菌对照样本区分开来。经统计分析，耻垢分枝杆菌特异性探针的检测下限为2.5 ng/μL，而针对IS6110的结核病探针的检测下限为5 ng/μL。序列比对显示，该探针与IS6110相关区域具有87%的相似性，这可能有助于在低严格性等离子体条件下实现有效的杂交反应。

结论

这项概念验证研究表明，一种结合磁性富集与等离子体生物传感技术的快速、可扩展且低成本的诊断平台有望用于分枝杆菌的检测。该整合型gMNP-GNP检测流程能够提高细菌回收率、增强显微镜下的观察效果，并且无需PCR扩增或复杂仪器即可实现分子层面的区分，因此在资源有限的地区开展结核病诊断的转化研究方面具有巨大潜力。不过，仍需使用结核分枝杆菌和患者样本进行临床验证。