一种用于环境样本全长16S rRNA基因纳米孔测序的混合型高性价比条形码策略

《BMC Genomics》：A hybrid and cost-efficient barcoding strategy for full-length 16S rRNA gene nanopore sequencing of environmental samples

　　

摘要

背景

在复杂的环境样本中准确识别细菌的物种级别对于生物技术、生态监测和临床诊断等领域而言至关重要。诸如Illumina这样的短读长测序平台通常会截断16S rRNA基因，从而限制了分类学的分辨率。在本研究中，我们对添加了木质纤维素生物质的天然土壤样本，以及从选择性及差异性羧甲基纤维素基底培养物中获得的简化微生物群落样本进行了牛津纳米孔技术的长读长16S rRNA测序，旨在比较真实复杂微生物群落与较简单系统之间的性能差异。

为降低消耗品成本，我们用自研的混合条形码策略替代了标准的ONT条形码试剂盒。具体而言，首先使用PacBio PCR基条形码协议对样本进行标记，然后再利用ONT连接测序试剂盒准备文库。这种简化方法既保持了与MinION和Flongle流式细胞的兼容性，还能实现准确的后续分型，同时大幅降低了条形码成本。此外，我们还开发了一套针对ONT数据的新生物信息学分析流程。

结果

总体而言，这种混合方案在保持高测序质量和通量的同时，显著降低了每份样本的条形码成本。此次测序共获得了超过5 Gb的经过质量过滤的数据（Q分数≥10）。此外，新的生物信息学分析流程使得49.38%的已注释分类单元能够被精确到物种级别，而使用Illumina NovaSeq对V3-V4区域进行测序时这一比例仅为4.59%。ONT还检测出了多2.3倍的属数和1.3倍的家庭数。尽管16S rRNA基因测序往往难以区分亲缘关系相近的物种，尤其是在分类学上较为复杂的群体中，但在本研究中，全长度读段大大提升了分类学的分辨率以及与数据库的匹配度。

结论

这些结果表明，结合低成本条形码策略的ONT全长度16S rRNA测序，其分类学分辨率优于短读长测序方法。这种方法为研究和应用领域中的高分辨率微生物组分析提供了一种可扩展且具有成本效益的解决方案。