百合NIN-like转录因子LlNLP7赋予耐热性并促进生长

《Molecular Horticulture》：Lily NIN-like transcription factor LlNLP7 confers thermotolerance and promotes growth

　　

在拟南芥中，NLP7（NIN-LIKE PROTEIN 7）已被确定为硝酸盐（NO₃^?）受体及植物氮信号通路的关键调控因子，在氮吸收和利用中发挥不可或缺的作用（Konishi and Yanagisawa 2013; Liu et al. 2022）。此外，在冷胁迫下，NLP7被CPK28（钙依赖蛋白激酶28）磷酸化，直接激活下游冷响应基因的表达（Ding et al. 2022）。最近，水稻和拟南芥的NLP7同源物被报道在耐热性中发挥作用（Zhao et al. 2025; Zhu et al. 2025）。然而，关于NLP7参与园艺作物温度胁迫响应的研究仍然稀少。百合（Lilium spp.）是一种重要的花卉作物，其耐热性较差，高温严重影响其品质，并显著限制全年生产（Li et al. 2024; Wu et al. 2026）。HSF（热激转录因子）是植物响应高温的核心调控组分；作为热信号通路中的末端组分，它们直接调控热响应基因以建立耐热性（Kan et al. 2023）。LlHSFA3A是介导百合耐热性的关键HSF成员（Wu et al. 2018, 2019, 2024），但其上游调控机制尚不清楚。通过酵母单杂交（Y1H）文库筛选，研究人员鉴定了LlNLP7作为LlHSFA3A的潜在直接调控因子。与拟南芥NIN-like转录因子家族的进化分析将LlNLP7定位在AtNLP7附近，因此命名为LlNLP7（图S1）。NLP7同源物的蛋白比对分析在LlNLP7的C端识别出NIN-like转录因子的典型RWP-RK和PB1结构域（图S1）。为研究高温对LlNLP7的激活作用，研究人员对暴露于热胁迫的百合叶片进行了实时定量PCR（RT-qPCR）分析。RT-qPCR结果显示，热处理0.5小时后LlNLP7的表达迅速激活，并持续表达至12小时，表明热胁迫诱导了其长期激活（图1A）。本氏烟草叶细胞中GFP融合蛋白的瞬时表达显示，GFP-LlNLP7的荧光信号与核标记物（NLS-RFP）部分重叠，表明在正常条件下LlNLP7部分定位于细胞核，属于核质定位蛋白；然而，在热胁迫条件下，GFP-LlNLP7主要定位于细胞核，表明高温促进了LlNLP7的核转位（图1B, S2）。核质分离实验的结果也证实了这一观察（图S2）。此外，研究人员通过转化胚性愈伤组织建立了百合中GFP-LlNLP7的稳定过表达（图S3）（Xiang et al. 2025）。类似地，在热胁迫下，GFP-LlNLP7转基因百合根细胞中的荧光信号从细胞质转位至细胞核（图1C, S4）。随后，研究人员利用酵母系统评估了LlNLP7的转录活性。结果表明，表达全长LlNLP7的酵母细胞在营养缺陷型SD培养基上生长良好，表明LlNLP7在酵母细胞中具有转录激活活性（图S5）。LlNLP7的蛋白截短分析揭示其N端具有转录激活能力，激活结构域位于N端P5区域（图S5）。接下来，研究人员构建了pEAQ-LlNLP7、pEAQ-LlNLP7-P5和pEAQ-LlNLP7-P9载体，并利用烟草叶片中的双荧光素酶报告系统评估它们在植物细胞中的转录能力。结果显示，与单独表达BD蛋白相比，BD-LlNLP7和BD-LlNLP7-P5均显著激活了GAL4 UAS驱动的LUC（荧光素酶）报告基因的表达，但BD-LlNLP7-P9未激活（图S5）。这些数据表明，LlNLP7在植物细胞中也具有转录激活能力，其N端P5区域贡献了该激活能力。Y1H实验证实LlNLP7直接结合到LlHSFA3A的启动子（图1D,E）。ChIP-qPCR（染色质免疫沉淀定量PCR）分析表明，LlNLP7在体内与LlHSFA3A启动子中包含硝酸盐响应顺式元件（NRE, 5’-TG[A/G]C[C/T]CTT-3’）的区域结合（图1F）。此外，EMSA（电泳迁移率变动分析）证明，LlNLP7在体外与含有NRE的生物素标记探针结合，而不与突变探针结合（图1G）。利用烟草瞬时表达系统，研究人员进行了双荧光素酶报告实验以研究LlNLP7与LlHSFA3A启动子结合的效果。结果显示，与对照相比，烟草叶片中LlNLP7的瞬时过表达增强了由LlHSFA3A启动子驱动的LUC活性（图1H, S6），表明LlNLP7通过直接结合其启动子激活LlHSFA3A的表达。为研究LlNLP7在百合中的作用，研究人员检测了LlNLP7过表达株系的耐热性（图1I）。基因表达分析显示，转基因株系中LlNLP7的表达增强，同时LlHSFA3A的表达显著增加（图1J,K）。此外，研究人员观察到LlHSFA1和LlHSFA2也被LlNLP7过表达激活（图S7）。选取生长一致的野生型和过表达百合植株作为实验材料（图1I）。热胁迫处理后，与野生型植株相比，过表达植株叶片萎蔫和黄化程度较轻，相对离子渗漏率较低，叶绿素含量较高（图S7）。DAB和NBT染色实验表明，过表达植株在热胁迫下积累的活性氧（ROS）较少（图S7）。H₂O₂和•O₂^?含量的检测进一步显示了类似结果（图S7）。这些数据表明，LlNLP7的过表达减轻了热诱导的细胞损伤，并增强了百合对热胁迫的抵抗力。此外，研究人员利用烟草脆裂病毒（TRV）介导的病毒诱导基因沉默（VIGS）系统沉默了百合植株中LlNLP7的表达，随后进行热胁迫处理以评估其耐热性（图S8）。在LlNLP7沉默的百合植株中，LlHSFA3A的表达在常温和高温条件下均受到抑制，LlHSFA1和LlHSFA2亦然（图S8），表明LlNLP7对它们的热诱导表达是必需的。热胁迫处理后，与TRV对照植株相比，LlNLP7沉默的百合植株表现出更严重的叶片萎蔫和黄化（图S8）。在热胁迫条件下，LlNLP7沉默植株表现出更严重的损伤、更高的相对离子渗漏率、降低的叶绿素积累以及ROS水平升高（图S8）。这些结果表明，沉默LlNLP7损害了百合细胞耐受高温环境的能力。总体而言，这些数据表明LlNLP7在耐热性中发挥积极作用。NLP7被认为是初级硝酸盐响应的中心枢纽，CPK10、CPK30和CPK32在硝酸盐响应中通过磷酸化促进NLP7的核滞留（Konishi and Yanagisawa 2013; Liu et al. 2017）。CPK28以钙依赖方式与NLP7互作，增强其在冷胁迫响应中的作用（Ding et al. 2022）。拟南芥的最新研究表明，热触发NLP7的转位不依赖于硝酸盐（Zhao et al. 2025）；类似地，水稻中NLP7同源物OsNLP3也在热胁迫响应中转位至细胞核（Zhu et al. 2025）；然而，它们是否也通过磷酸化修饰参与热胁迫响应仍有待进一步研究。研究人员的发现表明，百合LlNLP7受高温诱导，在热胁迫下蛋白转位至细胞核，激活LlHSFA3A的表达，从而促进耐热性的建立。尽管研究结果证明LlNLP7直接激活LlHSFA3A的表达，但研究人员也观察到LlNLP7和LlHSFA3A之间存在不同的表达模式。LlNLP7被高温持续诱导，而LlHSFA3A的热诱导表达在长时间热胁迫后出现下降（Wu et al. 2018）。这些看似矛盾的结果表明，LlHSFA3A的表达可能受其他因子调控，例如在长时间热胁迫条件下潜在的转录抑制因子被激活，从而抑制LlHSFA3A的表达。此外，在硝酸盐响应背景下，NLP7介导的调控通路中存在一个负反馈环路，其中NLP7的积累直接激活抑制其自身功能的下游抑制因子（Ruffel et al. 2025）。在热胁迫响应中是否存在类似的反馈机制仍有待阐明。不过，最近的研究在拟南芥和水稻中发现了类似的NLP-HSF调控模块（Zhao et al. 2025; Zhu et al. 2025），表明该模块在不同植物物种中是保守的。NLP7不仅参与硝酸盐的吸收和同化，还在植物温度胁迫响应中发挥保守作用。重要的是，研究人员还观察到，与野生型植株相比，LlNLP7过表达百合株系生长更快，鳞茎更大，株高增加（图1L-P, S9）。在拟南芥中，过表达其自身的NLP7，以及水稻OsNLP3或玉米ZmNLP6和ZmNLP8，均显著促进生长，类似结果已被观察到（Yu et al. 2016; Cao et al. 2017; Zhang et al. 2022）。这些发现，连同研究人员的实验结果，表明NLP7同源物在不同物种（包括双子叶植物、单子叶作物和非禾本科单子叶园艺植物）中在促进生长方面发挥类似作用。这些结果也强烈表明，NLP7直系同源基因是一个具有重要实践价值的潜在育种靶基因。NLP7的过表达不仅增强植物对低温和高温的耐受性，还促进生长。这些特征表明NLP7在作物改良和育种中具有广阔的应用前景，为提高农业生产力和应对气候变化提供了新策略。

**论文解读：百合NIN-like转录因子LlNLP7赋予耐热性并促进生长**

**研究背景与问题**
植物在生长发育过程中经常面临高温胁迫，严重影响作物产量和品质。热激转录因子（HSF）是植物响应高温的核心调控组分，直接激活热响应基因以建立耐热性。在百合（*Lilium* spp.）中，LlHSFA3A已被证实是介导耐热性的关键HSF成员，但其上游调控机制尚不清楚。此前，在拟南芥中，NLP7（NIN-LIKE PROTEIN 7）被鉴定为硝酸盐（NO₃^?）受体和氮信号通路的关键调控因子，并参与冷胁迫响应。最近，拟南芥和水稻的NLP7同源物被报道在耐热性中发挥作用，但园艺作物中NLP7参与温度胁迫响应的研究极少。百合作为重要花卉作物，耐热性差，高温严重影响其品质和周年生产。因此，阐明百合耐热性的分子调控机制具有重要的理论意义和应用价值。本研究旨在鉴定上游调控LlHSFA3A的转录因子，并探究其在百合耐热性和生长中的作用。

**研究内容与结论**
研究人员通过酵母单杂交（Y1H）文库筛选，鉴定出LlNLP7作为LlHSFA3A的潜在直接调控因子。进化分析表明LlNLP7与拟南芥AtNLP7亲缘关系最近，且含有典型的RWP-RK和PB1结构域。功能实验表明：高温诱导LlNLP7表达，并促进其蛋白从细胞质转位至细胞核；LlNLP7具有转录激活活性，其N端P5区域贡献该活性；Y1H、ChIP-qPCR和EMSA实验证实LlNLP7直接结合LlHSFA3A启动子中的硝酸盐响应顺式元件（NRE），并激活其表达。在百合中过表达LlNLP7增强了耐热性，表现为叶片萎蔫和黄化减轻、离子渗漏率降低、叶绿素含量升高、活性氧（ROS）积累减少；而沉默LlNLP7则导致耐热性下降。此外，过表达LlNLP7还促进了百合生长，表现为鳞茎更大、株高增加。该研究揭示了LlNLP7-LlHSFA3A调控模块在百合耐热性中的保守作用，并为NLP7作为育种靶基因提供了证据。论文发表在《Molecular Horticulture》。

**关键技术方法**
1. **酵母单杂交（Y1H）筛选**：用于鉴定与LlHSFA3A启动子结合的转录因子。
2. **实时定量PCR（RT-qPCR）**：检测基因表达水平变化。
3. **亚细胞定位分析**：通过GFP融合蛋白在烟草和百合细胞中的瞬时/稳定表达，结合共聚焦显微镜观察蛋白定位。
4. **染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）**：验证LlNLP7与LlHSFA3A启动子体内结合。
5. **电泳迁移率变动分析（EMSA）**：验证LlNLP7与NRE的体外结合。
6. **双荧光素酶报告系统**：在烟草叶片中评估LlNLP7对LlHSFA3A启动子的转录激活能力。
7. **病毒诱导基因沉默（VIGS）**：通过TRV载体沉默百合中LlNLP7表达，评估耐热性。
8. **稳定遗传转化**：通过胚性愈伤组织转化获得百合LlNLP7过表达株系。

**研究结果**
**1. LlNLP7受高温诱导并发生核转位**
RT-qPCR显示，热处理后LlNLP7表达迅速激活并持续至12小时。GFP融合蛋白亚细胞定位实验表明，正常条件下LlNLP7部分定位于细胞核，高温促进其核转位，核质分离实验进一步证实。

**2. LlNLP7具有转录激活活性**
酵母系统显示全长LlNLP7具有转录激活能力，截短分析表明激活结构域位于N端P5区域。烟草叶片双荧光素酶报告系统证实BD-LlNLP7和BD-LlNLP7-P5可激活报告基因表达。

**3. LlNLP7直接结合并激活LlHSFA3A**
Y1H证明LlNLP7与LlHSFA3A启动子结合。ChIP-qPCR显示LlNLP7与启动子中NRE区域结合。EMSA证实LlNLP7在体外与含NRE的探针结合，不与突变探针结合。双荧光素酶报告实验表明LlNLP7增强LlHSFA3A启动子活性。

**4. LlNLP7过表达增强百合耐热性**
过表达株系中LlNLP7及LlHSFA3A、LlHSFA1、LlHSFA2表达上调。热胁迫后，过表达植株叶片损伤轻，离子渗漏低，叶绿素含量高，ROS积累少（DAB和NBT染色、H₂O₂和•O₂^?含量测定）。

**5. LlNLP7沉默削弱百合耐热性**
VIGS沉默LlNLP7后，LlHSFA3A、LlHSFA1、LlHSFA2表达在常温和高温下均受抑制。热胁迫后，沉默植株叶片萎蔫严重，离子渗漏高，叶绿素降低，ROS升高。

**6. LlNLP7过表达促进百合生长**
与野生型相比，过表达株系鳞茎更大、株高增加，且生长加速（5周和11周时鳞茎直径和鲜重显著增加，叶片鲜重也增加）。

**讨论与结论**
讨论部分指出，NLP7在拟南芥中通过磷酸化介导核滞留参与硝酸盐和冷胁迫响应，而热胁迫下NLP7的核转位不依赖硝酸盐。本研究在百合中确认了类似机制，并发现LlNLP7与LlHSFA3A表达模式存在差异，提示LlHSFA3A可能受其他因子（如潜在抑制因子）调控。此外，在硝酸盐响应中存在NLP7负反馈环路，热胁迫下是否类似未知。最近在拟南芥和水稻中也发现保守的NLP-HSF调控模块，表明该模块在植物中广泛保守。NLP7不仅参与氮代谢，还保守地参与温度胁迫响应。研究结论：LlNLP7通过高温诱导的核转位直接激活LlHSFA3A表达，从而增强百合耐热性；同时，LlNLP7过表达促进百合生长，表明NLP7直系同源基因是兼具耐逆性和生长促进作用的潜在育种靶基因，在作物改良和应对气候变化中具有广阔应用前景。