氨曲南-阿维巴坦对伯克霍尔德菌复合体（Bcc）的抗菌和抗生物膜活性评估

《Folia Microbiologica》：Evaluation of the antimicrobial and antibiofilm activities of aztreonam-avibactam against the Burkholderia cepacia complex

　　

伯克霍尔德菌复合体（Bcc）产生的β-内酰胺酶（beta-lactamase）导致β-内酰胺类耐药并恶化患者预后。本研究描述了单环β-内酰胺类抗生素氨曲南（aztreonam）与β-内酰胺酶抑制剂阿维巴坦（avibactam）联合使用对Bcc分离株的活性。研究人员对浮游细胞进行了肉汤微量稀释（broth microdilution）和时间杀菌（time-kill）实验。此外，研究人员在补充有5%和10%牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）的培养基中重复了肉汤微量稀释实验，以评估其对最低抑菌浓度（MIC）的影响。研究人员在所有生物膜阳性分离株中测定了氨曲南/阿维巴坦对生物膜形成和成熟生物膜代谢活性的影响。此外，研究人员分析了选定菌株的生物膜基质中活菌数、总蛋白含量和胞外DNA（extracellular DNA, eDNA）浓度，并使用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）观察了生物膜结构。所有菌株均被确定为对氨曲南耐药，氨曲南/阿维巴坦的MIC₅₀和MIC₉₀分别为4/4 mg/L和8/4 mg/L。氨曲南/阿维巴坦对Bcc的浮游形式表现出活性，并降低了氨曲南的MIC值。血清白蛋白在低剂量时活性不显著，但在高剂量时对MIC影响更大。在29个分离株中，有25个观察到中等至强的生物膜形成，氨曲南/阿维巴坦对Bcc生物膜形成和成熟生物膜表现出菌株和浓度依赖性活性。该联合用药还减少了生物膜基质成分如总蛋白和eDNA，且在亚抑制浓度下观察到一些菌株特异性效应。这些发现支持氨曲南/阿维巴坦通过靶向浮游细菌和生物膜基质的关键组分，作为治疗Bcc感染的潜在选择。

**论文解读：氨曲南-阿维巴坦对伯克霍尔德菌复合体（Bcc）的抗菌与抗生物膜活性研究**

**研究背景与问题**
伯克霍尔德菌复合体（Burkholderia cepacia complex, Bcc）是一种存在于多种环境（包括医疗机构）中的机会性病原体，主要感染慢性或危重疾病患者及免疫功能低下个体，可导致脑膜炎、肺炎、血流感染和尿路感染等严重感染。自2020年1月以来，Bcc相关医疗保健相关感染呈上升趋势，常与受污染的消毒剂、超声凝胶和医疗产品相关，凸显了Bcc在全球健康中的负担。Bcc对多种抗菌药物（包括头孢菌素类、青霉素类、氨基糖苷类、多黏菌素类和四环素类）具有显著的内在耐药性，其耐药机制包括低外膜通透性、β-内酰胺酶产生、外排泵和靶点修饰。由于耐药性广泛，治疗选择极其有限。Bcc还能够形成生物膜，这是一种由微生物群落组成的生态系统，被胞外聚合物（extracellular polymeric substances, EPS）包裹，可逃避宿主免疫反应并增强抗生素耐药性，在慢性感染（尤其囊性纤维化患者）中起关键作用。尽管氨曲南（aztreonam）作为单环β-内酰胺类抗生素对金属β-内酰胺酶（metallo-beta-lactamases, MBLs）水解较稳定，但多数临床相关的丝氨酸β-内酰胺酶（如ESBLs、肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPCs）、AmpC β-内酰胺酶）可水解氨曲南。阿维巴坦（avibactam）是一种β-内酰胺酶抑制剂，可保护氨曲南免受丝氨酸β-内酰胺酶水解。氨曲南-阿维巴坦联合用药已显示出对多重耐药病原体的潜力，但针对Bcc的研究数据匮乏。因此，研究人员开展了本研究，以评估氨曲南-阿维巴坦对Bcc临床分离株的浮游细胞和生物膜相关活性。

**研究内容与结论**
研究人员从土耳其马尔马拉大学医学微生物学细菌库中获取了29株Bcc临床分离株（2019-2023年分离自气管吸出物、痰液和血液等标本），通过肉汤微量稀释法（broth microdilution）测定氨曲南及氨曲南/阿维巴坦（固定阿维巴坦浓度4 mg/L）的最低抑菌浓度（MIC），并评估了5%和10%牛血清白蛋白（BSA）对MIC的影响。时间杀菌实验针对6株分离株进行，测定不同浓度（0.5×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC）下的杀菌动力学。生物膜形成能力通过结晶紫染色法评估，并进一步研究了氨曲南/阿维巴坦对生物膜形成（MIC、1/5×MIC、1/10×MIC）和成熟生物膜代谢活性（MIC、2×MIC、4×MIC）的影响。对4株代表性菌株测定生物膜中活菌数、总蛋白含量（Bradford法）和胞外DNA（eDNA）浓度，并通过扫描电子显微镜（SEM）观察生物膜结构。

**主要结论**：
- 所有Bcc菌株对氨曲南耐药（MIC范围32->32 mg/L），而氨曲南/阿维巴坦的MIC₅₀和MIC₉₀分别为4/4 mg/L和8/4 mg/L，表明阿维巴坦显著降低了氨曲南的MIC值。
- 5% BSA使MIC₅₀和MIC₉₀翻倍，10% BSA使两者均升至32/4 mg/L，提示高剂量血清白蛋白可影响MIC。
- 时间杀菌实验显示，氨曲南/阿维巴坦活性呈菌株依赖性；4×MIC在24 h对菌株1和6达到≥3-log减少，但部分菌株在MIC及以上浓度出现再生现象。
- 29株中25株形成中等至强生物膜；氨曲南/阿维巴坦对生物膜形成和成熟生物膜代谢活性呈菌株和浓度依赖性抑制，MIC浓度下13株（52%）生物膜形成抑制>50%，4×MIC浓度下16株（64%）成熟生物膜代谢活性降低>50%。
- 亚抑制浓度（MIC/5、MIC/10）在某些菌株中反而促进生物膜形成。
- 在代表菌株中，MIC浓度降低生物膜内活菌数（仅部分菌株显著）、总蛋白和eDNA含量；但亚抑制浓度对菌株20的总蛋白水平有反常升高效应。
- SEM图像显示，MIC浓度处理后的生物膜结构显著改变，密度降低、基质减少。

**重要意义**：该研究首次系统评估了氨曲南/阿维巴坦对Bcc临床分离株的浮游和生物膜活性，证实其作为治疗Bcc感染潜在方案的可行性，并揭示了菌株间异质性和血清白蛋白对药效的影响，为优化给药策略和进一步研究提供了依据。论文发表在《Folia Microbiologica》。

**关键技术方法**
1. 肉汤微量稀释法（broth microdilution）：依据EUCAST标准，在不含或含5%/10%牛血清白蛋白（BSA）的阳离子调节Mueller-Hinton肉汤（CAMHB）中测定MIC，阿维巴坦固定浓度4 mg/L。
2. 时间杀菌实验（time-kill assay）：在CAMHB中，以氨曲南（0.5×至4×MIC）联合固定阿维巴坦处理6株Bcc，于0、2、4、6、24 h取样涂板计数，绘制时间-杀菌曲线。
3. 结晶紫染色法（crystal violet assay）：在含1%葡萄糖的胰酶大豆肉汤（g-TSB）中培养24 h，定量测定OD₅₇₀评估生物膜形成能力，并用于抑制实验。
4. MTT还原法：测定成熟生物膜代谢活性，于OD₅₉₅读数。
5. 生物膜组分分析：超声破碎后，通过Bradford法测定总蛋白，使用商品化DNA纯化试剂盒提取并定量eDNA（NanoDrop?分光光度计）。
6. 扫描电子显微镜（SEM）：固定、脱水、干燥后喷金，使用Hitachi SU8700场发射扫描电镜观察生物膜结构（样本来源：土耳其马尔马拉大学医学微生物学系细菌库）。

**研究结果**
**肉汤微量稀释结果**：Bcc分离株对氨曲南的MIC范围为32->32 mg/L，氨曲南/阿维巴坦的MIC范围为1/4-16/4 mg/L，MIC₅₀和MIC₉₀分别为4/4 mg/L和8/4 mg/L。5% BSA使MIC₅₀和MIC₉₀翻倍，10% BSA使两者均升至32/4 mg/L，表明高剂量BSA显著影响MIC。
**时间杀菌实验结果**：氨曲南/阿维巴坦活性呈菌株依赖性。2 h内各浓度均未导致细菌减少；MIC浓度通常防止初始菌数增加；亚MIC浓度与对照组无显著差异；4×MIC在24 h对菌株1和6达到≥3-log减少，但菌株1在2×MIC也达到3-log减少。部分菌株在MIC及以上浓度出现再生现象。
**生物膜实验结果**：29株中2株无生物膜、2株弱生物膜、9株中等、16株强生物膜。氨曲南/阿维巴坦对生物膜形成的抑制呈时间依赖性：MIC浓度下，24 h时13株（52%）抑制>50%，但部分菌株在亚抑制浓度下生物膜生物量增加。对成熟生物膜，MIC浓度下仅1株（4%）代谢活性降低>50%，2×MIC时4株（16%），4×MIC时16株（64%）降低>50%。在4株代表菌株中，MIC浓度下菌株23和24的活菌数显著减少（p<0.05），而菌株20和22无显著变化。总蛋白含量在MIC浓度下总体呈下降趋势，但仅一株显著；亚抑制浓度下菌株20的总蛋白出现显著升高（p<0.05）。eDNA含量在菌株20和23中在所有测试浓度下均显著降低（p<0.001），MIC浓度降幅最大。SEM图像显示，MIC浓度处理后菌株20和23的生物膜结构显著破坏，密度降低、基质减少。

**讨论与结论**
Bcc因其高耐药性和强生物膜形成能力，治疗选择极为有限。氨曲南/阿维巴坦对肠杆菌目和嗜麦芽窄食单胞菌的活性已有大量研究，但针对Bcc的数据匮乏。本研究表明，氨曲南/阿维巴坦可恢复氨曲南对Bcc的活性，MIC₅₀/MIC₉₀（4/8 mg/L）与既往研究（4/16 mg/L或8/16 mg/L）高度一致。然而，部分菌株在MIC及以上浓度出现再生现象，提示适应耐受机制（如外排泵激活、持留细胞存在）可能参与。血清白蛋白结合可降低游离药物浓度，本研究证实5% BSA影响较小，但10% BSA显著升高MIC，提示高蛋白血症可能影响药效，需体内研究验证。生物膜相关结果强调，氨曲南/阿维巴坦对生物膜形成和成熟生物膜均具活性，但需较高浓度（4×MIC）才能显著降低代谢活性；亚抑制浓度可能诱导某些菌株的应激反应，反而促进生物膜形成（如菌株20中总蛋白升高）。此外，eDNA在所有浓度下均被抑制，提示该联合用药可能干扰生物膜基质稳定性。总体而言，氨曲南/阿维巴坦作为治疗Bcc感染的候选方案具有潜力，但需考虑菌株间变异性和优化给药策略。
**研究结论**：氨曲南/阿维巴坦对Bcc浮游细胞和生物膜均表现出活性，可降低MIC、抑制生物膜形成、破坏成熟生物膜结构并减少基质成分（总蛋白和eDNA），但其效果呈菌株和浓度依赖性。这些发现支持氨曲南/阿维巴坦作为治疗Bcc感染的新型治疗选择，并强调在临床应用中需进行个体化药敏测试并维持有效治疗浓度。