来自太平洋牡蛎（*Magallana gigas*）的肽KSVSPKFLTG通过激活SHSY-5Y细胞中ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴发挥神经保护潜力

《Antioxidants》：Neuroprotective Potential of Peptide KSVSPKFLTG from Magallana gigas via Activating the ACE2/Ang-(1-7)/Mas Axis in SHSY-5Y Cells

　　

摘要：鉴于人们对促进健康食品的需求日益增长，食品源生物活性物质的多维调控效应及其机制引起了越来越多的关注。本文报道了源自太平洋牡蛎（*Magallana gigas*）的具有ACE2结合特性的抗炎肽KSVSPKFLTG，可保护SHSY-5Y细胞免受MPP⁺/FAC诱导的神经毒性。该肽可减轻SHSY-5Y细胞的氧化应激损伤，并改善线粒体膜电位（MMP）。同时，该肽通过激活肾素-血管紧张素系统（RAS），减轻铁过载并上调铁死亡相关保护蛋白（GPX4、SLC7A11、BCBP2、SLC40A1）的表达。这些发现揭示了牡蛎来源抗炎肽通过调节RAS发挥神经保护的新机制，同时为利用生物活性肽缓解炎症引起的神经损伤开辟了新途径。

论文解读：牡蛎肽KSVSPKFLTG通过激活ACE2/Ang-(1-7)/Mas轴保护SHSY-5Y细胞免受氧化应激与铁死亡损伤

**研究背景与问题**

外周炎症因子（如肺部、肝脏、肠道感染产生的细胞因子）可通过血液循环和迷走神经通路传播至中枢神经系统，引发全身性炎症反应，进而间接导致脑神经损伤和认知功能障碍，表现为记忆减退和意识混乱。肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system, RAS）中的血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2, ACE2）在炎症进程中扮演核心角色，其通过ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴发挥血管舒张、抗炎和组织再生等多效生理活性。然而，现有抗炎药物虽能有效上调ACE2表达并激活RAS轴，但常因不良反应而限制其临床应用。因此，天然活性分子受到越来越多的关注。海洋食物富含蛋白质和不饱和脂质，流行病学证据表明经常食用健康水产品与减轻炎症和增强记忆呈正相关。此前基于表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）筛选的研究已鉴定出一种源自牡蛎的肽KSVSPKFLTG，该肽可结合并激活ACE2，在体内降低促炎因子表达并减轻肺部炎症，但其在调节肺炎诱导的认知障碍中的潜在作用尚未明确。鉴于RAS关键组分（ACE2、Ang II、MAS1）在脑内广泛表达，尤其在参与认知和运动功能的海马和黑质区域，且脑内RAS失调与帕金森病（Parkinson's disease, PD）中多巴胺能神经元变性高度相关，研究人员推测该牡蛎来源抗炎肽可能通过调节脑内RAS平衡发挥神经保护作用。为验证这一假说，本研究采用1-甲基-4-苯基吡啶鎓（MPP⁺，一种选择性进入多巴胺能神经元并抑制线粒体复合物I的经典诱导剂）和枸橼酸铁铵（ferric ammonium citrate, FAC）构建多巴胺能神经元损伤模型，系统评估该肽对活性氧（reactive oxygen species, ROS）积累、线粒体膜电位丢失、铁过载及铁死亡相关信号因子表达的影响。

**研究内容与结论**

研究人员以人神经母细胞瘤SHSY-5Y细胞为模型，设置健康对照组（control）、模型组（MPP⁺/FAC）、低浓度肽组（62.5 μM）、中浓度肽组（125 μM）和高浓度肽组（250 μM）。实验采用CCK-8法检测细胞活力，DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平，JC-1流式细胞术评估线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP），普鲁士蓝染色和总铁离子含量测定评估铁沉积，Western blot检测ACE2、MAS1L、Nrf2、GPX4、BCBP2、SLC7A11和SLC40A1等蛋白表达，并测定GPX4活性、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。所有实验均重复三次，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD事后检验进行统计分析，p < 0.05为差异显著。

**主要结果**

**3.1 KSVSPKFLTG肽减轻SHSY-5Y细胞的氧化损伤**

首先确定肽的安全浓度范围，结果显示62.5、125、250 μM肽处理对细胞活力无显著影响，而500 μM以上浓度出现毒性，故选用这三个浓度。与对照组相比，MPP⁺处理使细胞活力下降34.15%（p < 0.0001），而肽处理显著提高细胞活力，250 μM组达到峰值。DCFH-DA荧光染色显示MPP⁺组细胞内ROS大量积累，肽处理后荧光强度随浓度增加呈下降趋势，250 μM组显著低于MPP⁺组（p < 0.01）。MDA含量测定表明MPP⁺诱导脂质过氧化，250 μM肽处理显著降低MDA含量（p < 0.01）。同时，MPP⁺使SOD活性从1.00降至0.29（p < 0.01），而250 μM肽组显著提高SOD活性（p < 0.01）。综上，KSVSPKFLTG肽清除ROS并抑制脂质过氧化，从而减轻MPP⁺介导的细胞氧化损伤。

**3.2 KSVSPKFLTG肽通过抗氧化依赖途径改善线粒体膜电位（MMP）**

JC-1流式细胞术检测发现，正常细胞主要分布于Q2区（高J-聚集体荧光，代表正常MMP），而MMP崩解的细胞转移至Q3区（单体荧光）。对照组Q2细胞比例为27.90 ± 1.18%，MPP⁺组降至14.10 ± 0.87%，表明MPP⁺显著触发MMP下降和线粒体损伤。经KSVSPKFLTG处理后，Q2细胞比例呈浓度依赖性恢复，250 μM组升至19.18 ± 1.30%，接近阳性对照雷沙吉兰（rasagiline）组（15.36 ± 2.39%），且优于解偶联剂CCCP组（10.39 ± 0.90%）。结果表明该肽有效逆转MPP⁺引起的MMP降低，减轻线粒体损伤。

**3.3 KSVSPKFLTG肽调节SHSY-5Y细胞的铁沉积**

普鲁士蓝染色显示MPP⁺组出现铁沉积斑块，而125 μM和250 μM肽处理后铁沉积明显减少。总铁含量定量测定表明MPP⁺显著加剧细胞内游离铁异常积累（p < 0.05），肽处理显著降低异常铁积累（p < 0.01）。此外，与MPP⁺组相比，125 μM和250 μM肽处理后GPX4活性显著增强（p < 0.01）。这些结果说明KSVSPKFLTG显著减少SHSY-5Y细胞铁沉积，从而减轻Fenton反应引起的ROS积累和氧化应激损伤。

**3.4 KSVSPKFLTG通过激活RAS轴抑制FAC诱导的SHSY-5Y细胞铁稳态和抗氧化防御失衡**

为验证该ACE2激活肽是否改善细胞内铁稳态和氧化应激，研究人员用FAC构建铁过载状态。Western blot结果显示，与对照组相比，FAC组ACE2含量显著降低33.83 ± 7.57%（p < 0.05），250 μM肽处理后ACE2含量显著恢复至1.28 ± 0.08%，高于FAC组的0.89 ± 0.08%（p < 0.05）。同时，250 μM组的MAS1L含量（1.03 ± 0.13%）也显著高于FAC组（0.70 ± 0.05%）（p < 0.05）。转录因子Nrf2在125 μM和250 μM肽组中表达显著上调（p < 0.05），达到与对照组相当的水平。此外，铁死亡相关蛋白标志物检测显示，250 μM肽组的GPX4和SLC40A1含量显著高于FAC组（GPX4: p < 0.01, SLC40A1: p < 0.001），BCBP2和SLC7A11含量也显著高于FAC组（BCBP2: p < 0.01, SLC7A11: p < 0.05）。这些结果表明，KSVSPKFLTG通过提升ACE2和MAS1L（保护性RAS轴核心组分）的表达，促进Ang II降解为Ang-(1-7)，触发下游Nrf2介导的抗氧化反应，重新平衡RAS轴，减轻神经元损伤，并改善细胞内铁稳态和氧化应激。

**3.5 ACE2激活肽抑制MPP⁺诱导的神经损伤**

为确认该肽维持神经元抗氧化微环境，研究人员在MPP⁺诱导的SHSY-5Y细胞中再次检测ACE2、Nrf2、SLC7A11、MAS1L、BCBP2和GPX4的表达，并以雷沙吉兰为阳性对照。与对照组相比，MPP⁺组ACE2表达下调26.18 ± 7.30%，250 μM肽处理显著上调ACE2水平（p < 0.001），雷沙吉兰组也显著上调（p < 0.01）。Nrf2和GPX4在MPP⁺组分别下调20.96 ± 1.28%和24.05 ± 4.17%，250 μM肽处理后两者水平显著高于MPP⁺组（Nrf2: 0.88 ± 0.12 vs 0.59 ± 0.04, p < 0.05; GPX4: 1.03 ± 0.07 vs 0.75 ± 0.07, p < 0.05）。此外，SLC7A11、MAS1L和BCBP2在MPP⁺组分别下调21.27 ± 3.52%、21.10 ± 1.35%和26.86 ± 8.35%，250 μM肽处理后均显著回升（p < 0.05），雷沙吉兰组亦显著回升（p < 0.01）。Western blot结果表明，KSVSPKFLTG处理上调ACE2、MAS1L、Nrf2、SLC7A11、GPX4和BCBP2的蛋白表达。ACE2和MAS1L是保护性RAS轴的关键分子，其表达增加意味着细胞内保护性ACE2/Ang-(1-7)/MAS1L信号级联活性增强，进而与Nrf2抗氧化通路协同，升高SLC7A11和GPX4水平，同时上调BCBP2以维持细胞稳态，共同减轻MPP⁺诱导的神经元损伤。

**讨论与结论**

本研究证实牡蛎来源肽KSVSPKFLTG通过激活ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴，在MPP⁺/FAC诱导的SHSY-5Y细胞损伤中发挥神经保护作用。该肽不仅减轻氧化应激和线粒体功能障碍，还通过调节RAS抑制铁死亡。其机制涉及：恢复ACE2和MAS1L表达，激活保护性RAS轴；促进Nrf2介导的抗氧化反应；上调GPX4、SLC7A11、BCBP2和铁输出蛋白SLC40A1，多层面调节铁稳态。研究同时指出，未分化SH-SY5Y细胞模型存在局限性，且肽与ACE2的精确相互作用机制、体内药代动力学、血脑屏障穿透能力及长期毒性尚需进一步研究。尽管如此，该研究为牡蛎来源活性肽作为RAS调节型神经保护剂提供了坚实的理论基础，并开辟了海洋生物资源高值化利用的新途径。

**结论**：本研究证明了源自*Magallana gigas*的ACE2激活肽KSVSPKFLTG对MPP⁺/FAC诱导的SHSY-5Y细胞损伤具有显著神经保护作用。该肽有效降低细胞内ROS积累，增强抗氧化防御，改善MMP丢失，减轻异常铁沉积。此外，KSVSPKFLTG上调ACE2及其下游效应分子MAS1L的表达，从而激活RAS，进一步促进Nrf2介导的抗氧化反应，并增强铁死亡相关保护蛋白（GPX4、SLC7A11、BCBP2和铁出口蛋白SLC40A1）的表达。综上，肽KSVSPKFLTG通过激活RAS轴保护神经细胞免受氧化应激和铁死亡损伤，揭示了该肽在体内炎症反应中同时发挥神经保护作用的新机制。