《Antioxidants》：Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Alleviate ?-Galactose-Induced Testicular Injury by Activating the Keap1/Nrf2 Pathway and Suppressing NLRP3-Associated Pyroptosis
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目的：评估人脂肪间充质干细胞是否能保护机体免受?-半乳糖（?-gal）诱导的衰老样睾丸损伤，并探讨Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）/核因子E2相关因子2（Nrf2）通路及含NLR家族Pyrin结构域蛋白3（NLRP3）相关细胞焦亡的参与情况。方法：通
目的：评估人脂肪间充质干细胞是否能保护机体免受?-半乳糖（?-gal）诱导的衰老样睾丸损伤，并探讨Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）/核因子E2相关因子2（Nrf2）通路及含NLR家族Pyrin结构域蛋白3（NLRP3）相关细胞焦亡的参与情况。方法：通过对小鼠连续8周皮下注射?-gal建立衰老样睾丸损伤模型，随后经尾静脉注射ADSCs。评估睾丸形态、血睾屏障（BTB）完整性以及衰老相关标志物（p16、p21）。体外实验中，使用TM4 Sertoli细胞建立衰老模型，并与ADSCs进行Transwell共培养。利用生化分析、免疫荧光、蛋白质印迹法（Western blotting）和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）评估氧化应激、炎症反应和细胞焦亡相关标志物。进一步使用药理学抑制剂考察Keap1/Nrf2-NLRP3轴的参与情况。结果：ADSC治疗显著缓解了由?-gal诱导的睾丸萎缩和组织病理学损伤，伴随衰老标志物p16和p21表达降低以及BTB相关结构的部分恢复。ADSCs还减轻了氧化应激，表现为活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平降低，超氧化物歧化酶（SOD）活性增加，且Nrf2及其下游抗氧化靶点（包括血红素加氧酶1（HO-1）和NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1））的表达增强。同时，ADSC给药抑制了NLRP3激活，减少了半胱天冬酶-1（caspase-1）的剪切，并降低了促炎细胞因子的表达。在TM4细胞中，抑制Nrf2削弱了ADSCs的保护作用，并伴随NLRP3相关信号的重激活；而抑制NLRP3则减轻了衰老和炎症相关改变，但未能恢复Nrf2活性。结论：ADSCs通过Keap1/Nrf2通路恢复氧化还原平衡、保留BTB相关结构并抑制NLRP3相关细胞焦亡，从而至少部分缓解了?-gal诱导的衰老样睾丸损伤。这些发现表明，基于ADSC的治疗可能成为治疗与年龄相关的男性生殖功能障碍的一种有前景的策略，但仍需使用遗传模型和功能性生育力终点进行进一步研究，以确认因果关系和转化相关性。
近年来，出于教育和职业规划等考量，全球选择推迟生育的夫妇日益增多，导致高龄父亲比例不断上升。男性生殖系统的衰老迹象最早可能在30岁即开始出现。睾丸作为男性生殖系统的核心器官，随着机体衰老会发生结构和功能的进行性退化，导致生育力下降和不良生殖结局，同时也增加了子代风险，凸显了研究男性生殖衰老的重要临床意义。目前的常规治疗手段相对有限：睾酮替代疗法虽能部分缓解雄激素缺乏症状，但外源性睾酮会通过负反馈抑制下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴，从而抑制内源性睾酮产生和精子发生，甚至导致生育力受损；辅助生殖技术虽能绕过受精障碍，但无法恢复睾丸微环境或修复潜在的细胞损伤。因此，亟需寻找能够改善睾丸微环境并保留内源性生殖功能的新型治疗策略。在此背景下，人类脂肪间充质干细胞（ADSCs）因其获取容易、高产、增殖能力强且免疫原性低，以及通过旁分泌信号产生强效抗炎和抗氧化作用的能力，成为治疗年龄相关疾病的有潜力候选方案。氧化应激和慢性炎症被认为是睾丸衰老的关键驱动因素，会导致BTB破坏、Sertoli细胞功能障碍和精子发生受损。实验证据表明，睾丸损伤常伴随核因子E2相关因子2（Nrf2）信号抑制、BTB相关结构蛋白受损以及NLRP3相关炎症和细胞焦亡通路激活。Nrf2通常通过减少ROS产生和抑制炎症成分转录，作为NLRP3炎症小体的负调节因子。然而，ADSCs是否能通过协调调节这些通路来缓解衰老样睾丸损伤尚不清楚。为探究此问题，研究人员开展了相关研究，发现ADSCs能够通过激活Keap1/Nrf2通路并抑制NLRP3相关细胞焦亡来缓解?-gal诱导的衰老样睾丸损伤。这一发现为开发基于干细胞疗法的男性生殖衰老治疗策略提供了合理的理论基础。该论文发表在《Antioxidants》期刊上。
在开展此项研究时，研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过皮下注射?-gal构建小鼠衰老样睾丸损伤模型，并经尾静脉注射ADSCs进行体内干预；利用TM4 Sertoli细胞系结合Transwell共培养系统建立体外衰老模型以评估ADSCs的旁分泌效应；运用生化分析、免疫荧光、蛋白质印迹法（Western blotting）和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测氧化应激、细胞焦亡及分子标志物表达水平；此外，使用Nrf2特异性抑制剂ML385和NLRP3特异性抑制剂MCC950进行药理学阻断 rescued 实验，以解析 Keap1/Nrf2-NLRP3 信号轴的上下游层级关系。细胞样本队列来源于遵义医科大学附属医院提供的3名健康捐赠者（经伦理委员会批准）的人腹部脂肪组织，动物模型构建使用的是6-8周龄的雄性C57BL/6J小鼠。
人脂肪间充质干细胞的分离与鉴定：研究人员从人腹部脂肪组织中成功分离并培养出ADSCs，这些细胞表现出典型的成纤维样形态。成脂和成骨诱导分化实验以及流式细胞术鉴定结果证实，分离的细胞高度表达CD73、CD90和CD105等间充质干细胞标志物，而几乎不表达CD34、CD45、CD11b和HLA-DR等造血和免疫相关标志物，完全符合国际细胞与基因治疗学会（ISCT）对间充质基质细胞的最小标准。
ADSCs缓解小鼠中由?-gal诱导的衰老样睾丸损伤：通过体内实验发现，?-gal处理组小鼠表现出明显的全身衰老表型及学习记忆能力下降。?-gal诱导后小鼠的睾丸指数显著降低，睾丸组织出现明显的萎缩、空泡变性和生精上皮紊乱，且衰老相关标志物p16和p21表达显著上调。而经过ADSC干预治疗后，睾丸指数得到恢复，组织病理学损伤得到明显缓解，p16和p21的mRNA和蛋白表达水平均相应降低。这表明ADSCs能有效缓解?-gal诱导的睾丸组织病理学损伤和衰老标志物的过度表达。
ADSCs缓解?-gal诱导的睾丸微环境损伤并支持紧密连接蛋白的连续性：研究发现，BTB完整性的破坏是睾丸衰老的核心表现。免疫荧光染色显示，?-gal处理显著减少了睾丸中标志Sertoli细胞的SOX9阳性细胞数量，且紧密连接蛋白Occludin的分布出现断裂和紊乱。Western blotting结果也证实了Occludin和间隙连接蛋白43（Connexin 43）的表达显著下降。ADSC治疗有效逆转了上述改变，增加了Sertoli细胞数量，恢复了Occludin的连续性，并部分恢复了具有增殖潜能的生精细胞数量。这表明ADSCs能通过保留Sertoli细胞的完整性和BTB相关结构来保护衰老睾丸中生殖微环境的结构基础。
ADSCs减少?-gal处理小鼠的睾丸炎症并减轻NLRP3相关信号：体内实验显示，?-gal处理增加了睾丸组织中caspase-1、cleaved caspase-1、caspase-3和cleaved caspase-3的表达，表明细胞死亡和炎症通路被激活。ADSC治疗后，cleaved caspase-1和cleaved caspase-3水平降低。进一步检测发现，作为caspase-1激活的直接上游触发因子，NLRP3在?-gal组显著上调，而ADSC给药明显抑制了其表达。同时，?-gal诱导的白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）等促炎因子的mRNA水平升高也在ADSC干预后得到部分恢复。这表明ADSCs能有效重塑睾丸局部微环境，沉默NLRP3/caspase-1炎症轴。
ADSCs通过激活Nrf2信号通路抑制衰老样小鼠睾丸中的氧化应激：生化分析表明，?-gal组小鼠血清SOD活性显著降低，而MDA含量显著增加，表明氧化应激加剧。检测抗氧化机制发现，?-gal处理降低了睾丸组织中Nrf2及其下游NQO1、过氧化氢酶（CAT）和HO-1的表达，同时增加了Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）的表达。ADSC治疗不仅改善了氧化平衡，还部分恢复了Nrf2及其下游抗氧化基因的表达并降低了Keap1水平。免疫荧光进一步证实了ADSCs对Nrf2和Keap1分布异常的部分纠正，表明其通过增强Nrf2相关的抗氧化防御来保护衰老样睾丸。
ADSCs改善TM4细胞中由?-gal诱导的衰老样损伤和氧化损伤：为探究Sertoli细胞的直接响应，研究人员利用TM4细胞和非接触Transwell共培养系统进行体外实验。结果显示，?-gal以浓度依赖性降低TM4细胞活力，并诱导SA-β-gal染色阳性细胞增加及p16和p21表达上调。ADSC共培养处理有效降低了这些衰老相关标志物，表明接触非依赖性旁分泌效应部分逆转了TM4细胞的衰老样表型。
ADSCs抑制经?-gal处理的TM4细胞中的细胞焦亡和氧化应激：Western blotting分析证实，?-gal在TM4细胞中促进了caspase-1和NLRP3的表达，而caspase-3变化不明显。更重要的是，?-gal挑战触发了执行性焦亡片段Gasdermin D-N端（GSDMD-N）和成熟IL-1β的显著积累，有力证明在TM4细胞中特异性激活了典型细胞焦亡而非细胞凋亡。与体内结果一致，?-gal增加了ROS和MDA水平，降低了SOD活性，并下调了Nrf2和HO-1的表达，而这些改变均被ADSCs部分逆转。
ADSCs通过Keap1/Nrf2-NLRP3轴发挥保护作用：为明确Nrf2在ADSC介导保护中的精确作用，研究人员使用Nrf2抑制剂ML385预处理TM4细胞。ML385显著削弱了ADSCs恢复Nrf2、HO-1和NQO1的能力，逆转了ADSCs对p16、p21和NLRP3的抑制作用，并彻底抵消了ADSCs对下游焦亡执行因子GSDMD-N和成熟IL-1β的抑制作用，表明ADSCs依赖Nrf2激活来沉默下游焦亡事件。使用NLRP3抑制剂MCC950的结果显示，阻断了NLRP3后可下调cleaved GSDMD和IL-1β成熟，减轻p16和p21等衰老相关改变，但未能恢复Nrf2、HO-1或NQO1等上游抗氧化元件的表达。这证实了在衰老相关损伤中，NLRP3及其下游焦亡执行因子作为Keap1/Nrf2轴的下游效应器发挥作用；阻断NLRP3虽能阻止焦亡及衰老改变，却无法恢复上游主抗氧化防御网络，从而验证了ADSCs通过Keap1/Nrf2-NLRP3轴发挥靶向保护的核心机制。
讨论部分指出，男性生殖衰老是一个涉及多因素的退化过程。传统睾酮替代疗法的长期应用存在抑制HPG轴等健康风险，因此旨在维持睾丸微环境稳态的再生医学策略具有重要临床价值。ADSCs因其独特的生物学优势及旁分泌作用，在各类年龄相关疾病中展现出巨大潜力。该研究的主要发现是ADSCs通过精准保留Sertoli细胞的结构完整性来稳定生精微环境，有效逆转了由?-gal引起的Sertoli细胞减少和核心连接蛋白Occludin的松散与断裂，而不仅仅是泛泛的组织修复。另一关键发现是，?-gal诱导的睾丸损伤激活了NLRP3介导的典型细胞焦亡信号，在TM4 Sertoli细胞模型中尤为显著，提示由NLRP3介导的细胞焦亡是?-gal诱导的Sertoli细胞丢失的首要驱动力。相较于以往多关注生殖细胞凋亡，本研究首次为ADSCs通过直接抑制NLRP3介导的细胞焦亡来挽救睾丸衰老中Sertoli细胞的丢失提供了直接证据，揭示了其有别于一般抗炎作用的机制。焦亡是炎症小体引发的一种程序性细胞死亡方式。氧化应激作为组织衰老的核心驱动力，其与Nrf2通路的抑制密切相关。通过ML385和MCC950的挽救实验，研究证实NLRP3位于Nrf2下游，构建了“ADSCs-Nrf2-抑制NLRP3-抑制细胞焦亡”的机制轴。
尽管研究在机制理解上做出了重要突破，但作者也指出了本研究存在的局限与未来需探索的方向。首先，?-gal诱导的模型应被视为加速氧化应激相关的衰老模型，而非对自然生理性睾丸衰老的完整复现；且实验用人ADSCs与小鼠C57BL/6J的组合仅作为概念验证模型。未来需借助基因敲除等遗传模型进行功能获得与缺失验证。其次，当前研究主要聚焦于生殖微环境和BTB结构的恢复，尚缺乏对功能性生育挽救的确凿证据，未来需纳入精子动力学参数等生育力终点指标。此外，尽管体外共培养证明了旁分泌的作用，但移植的ADSCs向睾丸归巢的直接证据尚未在体内得到验证。最后，ADSCs介导的保护可能涉及外泌体RNA和线粒体稳定等多维网络，未来需结合先进生物材料以克服细胞在衰老微环境中的长期存活和归巢效率不足等临床转化挑战。
研究结论部分总结指出，本研究提供了证据表明，ADSCs通过保留BTB相关结构、减少氧化应激与炎症损伤，并调节Keap1/Nrf2信号及NLRP3相关细胞焦亡，从而缓解了由?-gal诱导的小鼠衰老样睾丸损伤。这些改善伴随着细胞氧化应激的减轻与Nrf2通路激活，以及NLRP3炎症小体的下调。药理学抑制实验进一步支持了这些通路的参与，但需未来进一步研究以确立其因果关系和上游调控机制。总之，本研究表明ADSCs可能通过协调调节氧化还原稳态和炎症信号对衰老睾丸发挥保护作用，支持基于ADSC的方法在治疗年龄相关睾丸功能障碍方面的巨大潜力。
