基于乳糖酸偶联聚乙烯亚胺和氧化葡聚糖的具有抗氧化活性和细胞相容性的生物医学水凝胶生物粘合剂

《Pharmaceutics》：Biomedical Hydrogel Bio-Adhesive Based on Lactobionic Acid Conjugated Polyethylenimine and Oxidized Dextran with Antioxidant Activity and Cytocompatibility

　　

背景/目的：组织生物粘合剂作为传统伤口闭合方法的有效替代方案，已引起广泛关注，传统方法常受限于粘附不足和生物相容性差。方法：受自然界中利用动态共价相互作用的强健湿粘附策略启发，研究人员报道了一种通过席夫碱（Schiff base）键连接，基于乳糖酸偶联聚乙烯亚胺（LA-PEI）和氧化葡聚糖（ODex）简便制备的水凝胶生物粘合剂。结果：所制备的水凝胶呈现出三维互连多孔网络、可调控的溶胀率、典型的粘弹性、剪切稀化行为和自愈合能力。值得注意的是，水凝胶的溶胀率取决于组成，其中OLP11表现出超过1500%的最高溶胀率。该水凝胶生物粘合剂对多种表面（包括玻璃、金属、塑料、橡胶和木材）以及不同鸡器官（包括心脏、肝脏、脾脏和胃）均表现出强粘附性。此外，水凝胶具有优异的ABTS自由基清除活性、有效的细胞内活性氧（ROS）清除能力以及良好的血液相容性，所有水凝胶的溶血率均接近0%，低于5%的阈值。在与NIH 3T3成纤维细胞共培养后，水凝胶表现出良好的细胞相容性并促进细胞增殖，第3天的细胞存活率超过90%。结论：该设计产生了多功能水凝胶生物粘合剂，在伤口护理和组织修复应用中显示出巨大潜力。

**论文解读**

**研究背景与问题**

皮肤作为抵御病原体入侵的首要屏障，其完整性对于维持机体内稳态至关重要。然而，机械创伤、热损伤及代谢性疾病引起的慢性溃疡会破坏皮肤结构并损害其功能。全球范围内，与伤口相关的医疗支出每年高达数百亿美元。敷料作为直接接触伤口的核心材料，其性能决定了愈合质量与效率。传统敷料如纱布和棉垫仅提供基本隔离，功能有限，无法主动促进组织再生，且常因粘附伤口表面而在更换时造成二次损伤。水凝胶敷料因其三维多孔网络和优异的亲水性，可保持水分，创造持续湿润的愈合环境，从而降低感染风险并加速修复过程，已成为功能性伤口敷料发展的重要方向。其中，氧化葡聚糖（ODex）和聚乙烯亚胺（PEI）因其独特的化学结构和突出的理化性质被广泛用于伤口敷料。ODex可通过高碘酸钠选择性氧化获得醛基修饰，其活性醛基与聚合物的氨基通过席夫碱（Schiff base）反应，实现快速原位凝胶化，赋予体系动态可逆网络结构、可注射性和自愈合能力。PEI是一种阳离子聚合物，其链上密集分布的质子化氨基可通过静电相互作用破坏细菌细胞膜，赋予水凝胶内在抗菌活性，并释放铵离子中和酸性伤口微环境，促进成纤维细胞迁移和增殖。然而，PEI的高阳离子电荷密度导致细胞毒性、非特异性蛋白质吸附和炎症风险，且抗氧化能力和机械韧性不足。为克服这些限制，引入柔性亲水链段可屏蔽过量正电荷并赋予抗氧化功能和机械韧性。乳糖酸（LA）是一种由半乳糖和葡萄糖酸通过糖苷键连接的多羟基有机酸，具有良好的金属离子螯合和活性氧（ROS）清除能力。将LA接枝到PEI上可中和过量游离氨基，引入糖基靶向基团和多羟基抗氧化结构，改善生物安全性并调节伤口微环境。尽管已有研究将LA用于PEI改性，但将LA整合到ODex/PEI水凝胶中用于伤口愈合的研究尚属空白。因此，研究人员开发了一系列ODex/LA-PEI水凝胶，并系统表征了其微观结构、溶胀行为、力学性能、流变学、粘附性能、抗菌活性、抗氧化能力以及血液和细胞相容性。该论文发表在《Pharmaceutics》。

**主要技术方法**

研究人员采用EDC/NHS催化酰胺化反应合成乳糖酸偶联聚乙烯亚胺（LA-PEI），通过高碘酸钠选择性氧化葡聚糖制备氧化葡聚糖（ODex）。随后，将不同质量比的ODex与LA-PEI在磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）中混合，通过席夫碱交联制备三种水凝胶配方（OLP11、OLP13、OLP31）。利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和核磁共振氢谱（¹H NMR）验证化学结构；通过扫描电子显微镜（SEM）观察微观形貌；采用ABTS自由基清除实验评估抗氧化活性；使用流变仪测试流变学性能和自愈合能力；通过粘附实验（包括玻璃、金属、塑料、橡胶、木材及鸡器官）评估粘附性能；以大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）为模型进行抗菌活性测试；通过CCK-8法、活/死细胞染色和细胞划痕实验评估细胞相容性和细胞迁移能力；利用DCFH-DA探针检测细胞内ROS清除能力；通过溶血实验评估血液相容性。

**研究结果**

**3.1 OLP水凝胶的制备**
通过FT-IR和¹H NMR表征，证实LA成功接枝到PEI上形成酰胺键，ODex成功引入醛基。三种水凝胶（OLP11、OLP13、OLP31）的FT-IR谱图在1639 cm^-1处出现席夫碱C=N拉伸振动峰，证实了ODex醛基与LA-PEI氨基之间的共价交联。该峰强度顺序为OLP31 > OLP13 > OLP11，表明ODex/LA-PEI质量比为3:1时促进更多C=N键形成。平衡溶胀率实验显示，OLP11溶胀率显著高于OLP13和OLP31，归因于不同交联密度。拉伸测试表明，OLP31呈现近似线性曲线，具有高交联密度；OLP11可承受更大应力，具有更高延展性。

**3.2 OLP水凝胶的微观结构与吸水性能**
SEM图像显示所有水凝胶均具有多孔互连的三维网络结构。孔尺寸定量分析显示，OLP11平均孔径68.01 μm，OLP13为88.12 μm，OLP31为91.56 μm且孔径分布更宽。结构差异由交联密度决定：高交联密度（OLP11）抑制冰晶生长，形成细小均匀孔；低交联密度（OLP31）则产生大孔。

**3.3 OLP水凝胶的流变行为与自愈合能力**
流变测试显示，在频率和应变扫描中，所有水凝胶的储能模量（G′）均高于损耗模量（G″），表明典型粘弹性。应变扫描确定线性粘弹区（LVR）为10%以下。所有水凝胶在0.1-100 s^-1剪切速率范围内表观粘度急剧下降，呈现非牛顿假塑性行为（剪切稀化）。三步阶跃应变循环测试显示，水凝胶在破坏后能快速恢复，证明自愈合能力，归因于动态亚胺键（C=N）的可逆断裂与重组。

**3.4 水凝胶的粘附性能**
水凝胶对玻璃、金属、塑料、橡胶、木材及鸡心、肝、脾、胃均表现出强粘附性。粘附力源于化学键（醛基与氨基的席夫碱反应）和物理相互作用（PEI阳离子与带负电细胞膜之间的静电吸引力）的协同效应。

**3.5 水凝胶的抗氧化与抗菌性能**
ABTS自由基清除实验显示，所有水凝胶处理组的清除率均超过90%，归因于氨基的供电子能力、醛基的供氢能力以及多羟基的稳定作用。抗菌实验表明，水凝胶对E. coli和S. aureus均有一定抑制作用。OLP13对E. coli抑制率58.70%，对S. aureus抑制率80.08%，显著高于其他配方。抗菌活性源于PEI正电荷介导的静电吸附和醛基的席夫碱交联作用，共同破坏细菌表面结构。

**3.6 水凝胶的溶血与体外细胞ROS清除性能**
溶血实验显示，所有水凝胶的溶血率均低于5%（FDA标准），表明良好血液相容性。乳糖酸接枝有效屏蔽了PEI的过量正电荷，减少对红细胞膜的损伤。DCFH-DA染色实验表明，水凝胶处理组细胞内绿色荧光强度较H₂O₂阳性对照组显著降低，证明水凝胶具有有效的细胞内ROS清除能力，归因于残余醛基、动态席夫碱键和富胺PEI骨架的协同作用。

**3.7 OLP水凝胶的细胞相容性**
活/死细胞染色和CCK-8实验表明，所有水凝胶提取物培养的NIH 3T3细胞中红色死细胞极少，活细胞密度随时间增加。OLP31组细胞活力最高，第3天细胞活力超过600%；OLP13次之；OLP11最低。所有组细胞活力均随时间呈上升趋势，证明水凝胶具有良好的细胞相容性并促进细胞增殖。

**3.8 OLP水凝胶的细胞促迁移能力**
细胞划痕实验显示，培养12 h后，OLP11组迁移率与对照组相近（约45%），而OLP13和OLP31组迁移率显著低于对照组。OLP11因ODex与LA-PEI等质量比，达到更优的电荷与组成平衡，避免过量正电荷或游离醛基干扰细胞表面蛋白功能，从而表现出最佳促迁移能力。

**总结与结论**

讨论部分指出，本研究通过席夫碱交联成功制备了ODex/LA-PEI复合水凝胶粘合剂，其具有可调多孔结构、良好溶胀性、自愈合能力、强组织粘附性以及优异的抗氧化、抗菌、血液相容性和细胞相容性。OLP11配方表现出最佳促细胞迁移效果，而OLP31显著增强细胞活力。这些特性使该水凝胶可根据不同应用场景进行定制，在伤口护理和组织修复中具有广阔前景。结论部分翻译如下：总之，本研究通过ODex与LA-PEI之间的席夫碱交联成功制备了复合OLP水凝胶粘合剂。该水凝胶具有可调多孔结构、良好的溶胀性能、自愈合能力、强组织粘附性以及优异的抗氧化、抗菌、血液相容性和细胞相容性。虽然当前研究展示了有前景的体外结果，未来工作将聚焦于使用合适的动物模型进行体内伤口愈合评估，以进一步验证OLP水凝胶系统的转化潜力。值得注意的是，OLP11配方表现出最佳促细胞迁移效果，而OLP31显著增强细胞活力。因此，这种复合OLP水凝胶生物粘合剂可根据不同应用场景进行定制，在生物医学应用中展现出广阔潜力。