蛋壳–海藻酸钠/聚乙烯醇复合水凝胶载体包埋根瘤菌及其储存性能研究

《Gels》：Preparation of Eggshell–Sodium Alginate/Polyvinyl Alcohol Composite Hydrogel Carrier-Embedded Rhizobacteria and Their Storage Properties

　　

根瘤菌接种剂在可持续农业中通过增强生物固氮发挥着关键作用；然而，在储存期间维持根瘤菌的存活率仍然是一个巨大的挑战。本文中，研究人员制备了六种包埋根瘤菌制剂（分别命名为E-SA/PVA R1至E-SA/PVA R6），这些制剂是通过包埋法使用海藻酸钠(SA)、聚乙烯醇(PVA)和蛋壳粉作为主要材料，以不同的成分比例制备而成。结构表征证实了复合水凝胶载体适用于根瘤菌的包埋：傅里叶变换红外(FTIR)光谱和热重分析(TGA)揭示了SA与PVA之间的有效交联，形成了稳定的基质。扫描电子显微镜(SEM)证实了载体内部成功包埋了丰富的根瘤菌。采用压汞法(MIP)对复合载体的孔隙结构进行了表征，揭示了孔隙率、平均孔径和渗透率之间的关系。使用三种具有不同分子量的探针分子进行传质评估，得出了扩散渗透系数(DPC)，定量阐明了载体基质内依赖于大小的传输行为。所有包埋制剂在土壤环境中均表现出良好的生物降解性。值得注意的是，在各种pH值和温度条件下，即使经过60天的储存，所有包埋制剂中的活菌数仍保持在8 log CFU/g以上，满足中国的微生物肥料标准，确立了它们作为实际根瘤菌接种剂应用的有前途的候选者。

为了满足人口增长驱动的不断升级的粮食需求，现代农业广泛依赖化肥和农药等农用化学品来维持高作物产量。然而，这些投入品的长期密集使用引发了土壤板结、肥力退化、水污染和空气污染等一系列生态环境问题，破坏了耕地的可持续生产力。微生物肥料由于具备环保特性和提升生产力的潜力，逐渐成为研究热点。根瘤菌能够与豆科植物形成共生关系并通过建立根瘤进行生物固氮，其接种剂被广泛用于提高作物生产力和土壤肥力。尽管根瘤菌接种剂具有重要的农学意义，其实际应用却受限于根瘤菌在储存和运输期间的有限存活率。游离的根瘤菌对高温、极端pH值和干燥等不利环境条件高度敏感，会迅速降低其存活率和固氮功效。

固定化技术，特别是将细胞包埋在水凝胶珠中的包埋法，因操作简单、条件温和且可扩展而备受关注。海藻酸钠(SA)是一种从褐藻中提取的天然多糖，因其优异的生物相容性、生物降解性和在二价阳离子存在的条件下易于凝胶化的特性而被选为基质材料。然而，基于SA的载体在水环境中通常机械强度不足且过度溶胀。聚乙烯醇(PVA)是一种合成水溶性聚合物，常与SA结合以改善机械性能和结构稳定性，但其致密的聚合物网络会抑制细胞增殖并阻碍传质。蛋壳作为一种丰富的农业废弃物，主要由碳酸钙组成，还含有锌、铜、锰等微量元素，不仅能为微生物生长提供额外营养，还能增强载体的机械性能。此外，蛋壳粉的引入可以带来额外孔隙，增强营养交换，并通过离子交联进一步稳定海藻酸盐基质。研究人员开展了将蛋壳粉引入SA/PVA复合水凝胶，系统地探究不同蛋壳含量、颗粒粒径及SA/PVA比例对载体孔隙结构、传质、根瘤菌存活率及储存性能影响的研究，并得出该复合水凝胶在维持根瘤菌长期存活方面具有显著优势的结论。该研究为根瘤菌接种剂的保存提供了实用且可持续的解决方案，对推动绿色农业发展具有重要意义，相关论文发表于《Gels》期刊。

研究人员取自当地市场的蛋壳以及由甘肃农业大学Yao教授课题组提供的根瘤菌(GAU00124)作为研究样本。在关键技术方法上，研究人员采用了包埋法，将特定浓度的根瘤菌悬浮液与杀菌后的SA、PVA及蛋壳粉混合后，滴入含有氯化钙和硼酸的交联溶液中，制备了球形珠和凝胶块状的E-SA/PVA复合水凝胶。为评价传质性能，选取葡萄糖、维生素B12(VB12)和牛血清白蛋白(BSA)作为探针分子，并基于Fick第二定律计算扩散渗透系数(DPC)。利用压汞法(MIP)测量复合材料的孔径分布、平均孔径、孔隙率和渗透率。通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)进行官能团分析，利用扫描电子显微镜(SEM)观察表面形貌并确认包埋情况，采用热重分析(TGA)评估热稳定性。将包埋样本埋于土壤中测定生物降解率。最后，将包埋菌剂置于不同的pH值、温度和NaCl浓度条件下储存60天，采用平板计数法计算活菌数，以此评估储存稳定性。

传质性能
研究人员通过测量葡萄糖、VB12和BSA三种不同分子量探针分子的扩散来评估传质性能。结果表明，E-SA/PVA 3对三种探针分子均表现出最高的扩散渗透系数(DPC)值，反映了其异常开放的孔隙结构。小分子葡萄糖扩散较快，中等分子的VB12扩散速率对孔隙结构敏感，而大分子BSA扩散最慢。这证实了高孔隙率和适中的孔径协同促进了分子传输。

压汞法(MIP)分析
通过压汞法对SA/PVA和E-SA/PVA 1–6的孔隙结构进行表征。数据显示，不同配方的平均孔径、孔隙率和渗透率存在差异。E-SA/PVA 2和E-SA/PVA 5表现出最佳的孔隙结构特征，结合了高孔隙率和适中的平均孔径与渗透率。高孔隙率促进了营养物和代谢物的交换，适中的孔径提供了足够的表面积供细菌附着并防止过度淋溶。SA/PVA比例和蛋壳含量的变化影响了交联密度和复合网络间隙的形成。

傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析
通过FTIR光谱分析原始组分及包埋根瘤菌制剂。光谱位移证实了复合材料中SA与Ca²⁺离子之间形成了“蛋盒”结构，表明存在离子交联。同时，在约823 cm^-1处观察到残留B(OH)₄^-的B–O伸缩振动，表明存在未反应的硼酸根离子。蛋壳粉的特征CO₃^2-峰在复合物中被观察到，证实粉末附着在载体表面，部分参与了交联反应。

热重分析(TGA)
TGA结果显示E-SA/PVA R1–6呈现三阶段热分解过程。加入蛋壳后，复合材料因孔隙结构增加导致起始降解温度略低，但其高温热稳定性显著增强。50%质量损失温度(T_50%)由368.5 °C大幅提升至482.0–777.0 °C，最大降解速率温度(T_max)和残余质量均有所提高。其中球形的E-SA/PVA R6表现出最佳高温稳定性。立方体的R3因交联网络较松散，热参数低于相同配方的球形R2。

扫描电子显微镜(SEM)分析
SEM图像显示纯SA/PVA载体表面相对平坦且交联紧密，而E-SA/PVA R1–6表面更粗糙，具有皱纹和较大孔隙。包埋后，观察到大量杆状根瘤菌粘附在孔隙表面并嵌入聚合物基质中，证实包埋成功。R2和R3中观察到大量根瘤菌聚集，这归因于其特定的微观结构提供了有利的细菌聚集空间构型。

生物降解性
在土壤中35天的降解测试表明，E-SA/PVA 6降解率最高达80.93%，E-SA/PVA 5为77.46%，可能因其优异的渗透率和较大孔隙促进了微生物渗入。但过高的降解率可能导致根瘤菌过早释放。E-SA/PVA 1降解率最低仅23.29%，因其结构致密且渗透率低。E-SA/PVA 2–4表现出适中的降解率，利于持续释放。

储存稳定性
在pH影响实验中，经过60天储存于28 °C及不同pH条件下，所有六种包埋制剂的活菌数均保持在8 log CFU/g以上。游离根瘤菌对pH波动高度敏感，在极端pH下存活率大幅下降，而包埋制剂有效抵御了环境胁迫。E-SA/PVA 5在整个储存期间表现出最稳定的菌体存活率。
在温度影响实验中，包埋制剂在4 °C、28 °C和37 °C储存60天后，活菌数均超过8 log CFU/g，而游离根瘤菌受到严重抑制，证实了复合载体对温度胁迫的显著保护作用。
在NaCl浓度影响实验中，盐浓度对游离根瘤菌的抑制作用显著，引发细胞脱水等现象。而包埋载体的水凝胶基质作为物理屏障缓冲了渗透冲击，且蛋壳释放的Ca²⁺离子有助于在盐胁迫下稳定细胞膜。结果表明，E-SA/PVA R2–4和E-SA/PVA R6能在盐胁迫土壤中作为微生物肥料应用。

结论
本研究制备了六种具有不同成分比例的蛋壳–海藻酸钠/聚乙烯醇(E-SA/PVA)复合载体用于根瘤菌包埋。FTIR和TGA证实了SA与PVA之间的有效交联以及蛋壳加入带来的热稳定性提升。MIP和传质实验表明E-SA/PVA 2和E-SA/PVA 5具有最理想的孔隙结构和扩散性能。SEM观察证实了根瘤菌的成功包埋。生物降解测试显示E-SA/PVA 2–4在35天内表现出52.07%至62.94%的适度降解率，确保了结构完整性和控释之间的平衡。在各种pH和温度条件下储存60天后，所有制剂的活菌计数均保持在8 log CFU/g以上，复合载体对严重影响游离根瘤菌的不利条件提供了有效保护。这些载体为根瘤菌接种剂配方提供了可扩展且低成本的策略，在土壤改良中具有潜在应用价值。