NCOA4介导的铁蛋白自噬在小鼠衰老成肌细胞铁过载驱动的铁死亡中发挥作用

《Cells》：NCOA4-Mediated Ferritinophagy Contributes to Iron Overload-Driven Ferroptosis of Senescent Myoblasts in Mice

　　

少肌症是一种与年龄相关的病理综合征，其特征是骨骼肌质量和功能的进行性及全身性丧失，肌肉萎缩是其核心病理标志。铁死亡是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，已被认为与肌肉萎缩的发病机制有关；然而，铁失调在少肌症中的确切作用仍不完全清楚。在本研究中，研究人员在D-半乳糖（D-gal）诱导的衰老成肌细胞中鉴定出铁死亡，证据包括细胞内铁水平和脂质过氧化升高、丙二醛（MDA）含量增加以及前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、4-羟基壬烯醛（4-HNE）和长链酰基辅酶A合成酶4（ACSL4）表达上调，同时谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、SLC7A11（xCT）和谷胱甘肽（GSH）水平降低，并伴有明显的线粒体损伤。值得注意的是，使用铁螯合剂去铁胺（DFO）处理可显著减轻衰老相关的铁死亡。此外，D-gal诱导的成肌细胞衰老伴随铁蛋白表达降低和核受体共激活因子4（NCOA4）水平升高，这些变化均可被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）或NCOA4敲低逆转，表明NCOA4介导的铁蛋白自噬参与了衰老诱导的铁过载和铁死亡。此外，衰老成肌细胞表现出活性氧（ROS）生成增加和线粒体损伤，这归因于胞质铁过载介导的线粒体铁转运蛋白2（Mfrn2）上调，从而促进线粒体铁输入。最后，通过DFO或铁抑素-1（Ferr-1）对铁过载或铁死亡进行药理学抑制，有效改善了衰老少肌症小鼠的骨骼肌萎缩和功能衰退。总之，这些发现阐明了少肌症的机制基础，并强调了靶向铁失调和铁死亡的潜在治疗途径。

**研究背景与问题**

少肌症是与年龄相关的骨骼肌质量和功能进行性丧失的病理综合征，严重影响老年人生活质量，增加跌倒、残疾和死亡风险。随着年龄增长，骨骼肌中约15%的全身铁储备发生失调，出现铁过载现象。铁过载通过Fenton反应产生毒性羟自由基，加剧氧化应激，并诱导铁死亡——一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式。研究人员前期在SAMP8衰老小鼠中发现骨骼肌铁过载和脂质过氧化，铁过载可诱导成肌细胞铁死亡，并被铁螯合剂或铁死亡抑制剂有效缓解。然而，年龄相关铁过载如何导致成肌细胞铁死亡的确切分子机制尚不完全清楚。本研究旨在探讨年龄依赖性铁积累的调控机制，研究铁过载诱导成肌细胞铁死亡的信号通路，并评估铁过载在少肌症进展中的潜在作用。论文发表在《Cells》。

**主要技术方法**

研究人员采用D-半乳糖（D-gal）诱导C2C12成肌细胞衰老模型（细胞来源：中国科学院上海生命科学研究院细胞库），并通过铁螯合剂去铁胺（DFO）、铁死亡抑制剂铁抑素-1（Ferr-1）及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）进行药理学干预。利用小干扰RNA（siRNA）敲低NCOA4和Mfrn2基因表达。采用FerroOrange和Mito-FerroGreen荧光探针分别检测细胞内及线粒体Fe²⁺水平，C11-BODIPY评估脂质过氧化，JC-1染色检测线粒体膜电位，MitoSOX检测线粒体ROS，透射电镜观察线粒体超微结构。体内实验使用年轻（3月龄）和衰老（22月龄）C57BL/6J雄性小鼠（来源：上海斯莱克实验动物有限责任公司），对胫骨前肌（TA）局部注射DFO或Ferr-1进行干预，评估抓力、跑台力竭实验及肌肉收缩力等指标。

**研究结果**

**3.1 铁过载和铁死亡在D-gal诱导的衰老成肌细胞和衰老小鼠骨骼肌中被触发**

D-gal处理C2C12细胞导致细胞活力浓度依赖性下降，SA-β-gal阳性细胞增多，衰老标志物P16、P21和γ-H2AX表达上调，成肌分化标志物肌球蛋白重链（MyHC）降低，肌肉萎缩相关基因Fbxo32和Trim63升高。FerroOrange染色显示细胞内Fe²⁺显著积累，脂质过氧化增加，铁死亡标志物PTGS2 mRNA、ACSL4和4-HNE蛋白上调，GPX4和xCT蛋白降低，GSH减少而MDA升高。透射电镜观察到线粒体嵴减少或消失、外膜破裂等铁死亡特征性形态。在24月龄衰老小鼠TA肌肉中，铁含量显著增加，NADPH和GSH降低，MDA升高，Ptgs2 mRNA上调，GPX4蛋白表达下降。

**3.2 降低细胞内铁水平可减轻D-gal诱导的衰老成肌细胞铁死亡**

DFO处理有效降低衰老成肌细胞中升高的Fe²⁺水平，与Ferr-1类似，显著减轻脂质过氧化，降低Ptgs2 mRNA、4-HNE和ACSL4蛋白及MDA含量，恢复GPX4和xCT蛋白表达及GSH水平，并保护线粒体超微结构完整性。

**3.3 衰老诱导的细胞内铁过载触发铁蛋白自噬**

D-gal诱导的衰老成肌细胞中，铁蛋白轻链（FTL）和重链（FTH）显著下调，转铁蛋白受体1（TfR1）上调，铁转运蛋白1（FPN1）下调。自噬抑制剂3-MA处理可逆转这些变化，降低细胞内Fe²⁺水平，减轻脂质过氧化和铁死亡，表现为Ptgs2 mRNA、4-HNE、ACSL4和MDA降低，GPX4、xCT、NADPH和GSH恢复。

**3.4 NCOA4参与衰老诱导的铁蛋白自噬**

D-gal处理显著上调NCOA4 mRNA和蛋白水平，衰老小鼠TA肌肉中NCOA4免疫组化染色增强。siRNA敲低NCOA4可逆转衰老导致的FTH下降，降低细胞内不稳定铁池，减轻脂质过氧化和铁死亡，表现为Ptgs2 mRNA、4-HNE、ACSL4和MDA降低，GPX4、xCT、NADPH和GSH恢复。

**3.5 细胞内铁过载导致线粒体铁水平升高和随后的线粒体功能障碍**

D-gal诱导衰老导致线粒体碎片化和核周聚集，线粒体膜电位（MMP）降低，ATP水平下降，线粒体ROS和Fe²⁺增加。DFO处理可逆转这些变化。衰老成肌细胞中Mfrn2 mRNA上调，Ftmt mRNA下调，DFO处理可恢复。敲低Mfrn2显著减轻线粒体ROS和Fe²⁺水平。

**3.6 抑制铁过载或铁死亡可减轻衰老诱导的小鼠骨骼肌萎缩**

对衰老小鼠TA肌肉局部注射DFO或Ferr-1显著增加肌肉质量，改善肌肉收缩特性（1/2松弛时间和特定单收缩力），增强抓力和跑台运动表现（力竭时间和距离）。免疫荧光显示DFO和Ferr-1处理减少I型和IIa型肌纤维比例，增加IIb型比例，增大肌纤维横截面积（CSA），降低萎缩标志物Fbxo32和Trim63，以及炎症因子IL-1β、TNF-α和纤维化相关基因Col1a1、Col3a1的表达。透射电镜显示处理组线粒体形态恢复，铁含量、MDA和Ptgs2 mRNA降低，NADPH和GSH升高，GPX4和xCT蛋白上调，ACSL4和4-HNE下调。

**讨论与结论**

讨论部分指出，铁代谢在衰老过程中起关键作用，与年龄相关的铁稳态失调导致组织铁积累，触发铁死亡。D-gal高浓度诱导的细胞毒性可能同时激活其他细胞死亡途径，但DFO和Ferr-1的部分保护作用表明铁死亡是主要贡献者。NCOA4介导的铁蛋白自噬通过释放游离铁导致铁过载，进而上调Mfrn2促进线粒体铁输入，引起线粒体ROS过度产生和脂质过氧化，最终导致成肌细胞铁死亡。药理学抑制铁过载或铁死亡可有效改善衰老小鼠的骨骼肌萎缩和功能衰退。

结论部分总结：本研究提示衰老成肌细胞中的铁过载和铁死亡可能促进少肌症的发病机制，使用铁螯合剂DFO或铁死亡抑制剂Ferr-1治疗可减轻这些效应，可能改善衰老小鼠的肌肉质量和功能。机制上，衰老可能通过上调NCOA4促进铁蛋白自噬，释放游离铁，进而激活成肌细胞线粒体膜上的Mfrn2，介导胞质游离铁进入线粒体，导致线粒体铁过载和ROS过量产生，最终引发脂质过氧化和成肌细胞铁死亡。该通路可能是少肌症的一个潜在机制。