低频交变磁场辅助液体发酵对金顶侧耳胞外多糖结构特性及生物合成的影响

《Foods》：Effect of Low-Frequency Alternating Magnetic Field-Assisted Liquid Fermentation on Extracellular Polysaccharides Structural Characteristics and Biosynthesis of Pleurotus citrinopileatus

　　

研究人员将低频交变磁场（LF-AMF）应用于金顶侧耳（Pleurotus citrinopileatus）液体发酵以生产胞外多糖（EPS）。在正常发酵条件下，金顶侧耳分泌两种类型的EPS（POL1和POL2），而在LF-AMF辅助发酵下仅产生一种类型的EPS（POL3）。研究表明，LF-AMF辅助发酵改变了EPS的单糖组成、组分单糖摩尔比及分子量分布。LF-AMF以浓度依赖和剂量特异的方式增强了EPS的絮凝活性。转录组分析显示，在LF-AMF辅助发酵与正常发酵的金顶侧耳之间共鉴定出32,413个差异表达基因（DEGs）（|log₂(fold-change)| ≥ 1，p < 0.05），其中5,818个基因上调，26,595个基因下调。这些DEGs富集于代谢途径和次生代谢物生物合成通路。糖酵解和糖异生相关基因，如己糖激酶、6-磷酸果糖激酶、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和葡萄糖-1,6-二磷酸酶，表达上调。此外，三羧酸（TCA）循环中的基因，包括柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶，也表达上调。这些发现表明，LF-AMF诱导的糖酵解转录变化可能调节EPS生物合成前体的代谢供应，从而影响生物合成过程并改变EPS的组成特性。

**论文解读：低频交变磁场辅助液体发酵对金顶侧耳胞外多糖结构特性及生物合成的影响**

**研究背景**
金顶侧耳（*Pleurotus citrinopileatus*）是一种珍贵的药食两用真菌，富含多糖、膳食纤维、蛋白质、氨基酸及多种矿物质。其多糖具有抗氧化、抗炎、保肝和免疫调节等多种生物活性，传统上从子实体中提取，但田间栽培周期长、环境条件难控。液体发酵可快速获得菌丝体和发酵液，是工业化生产多糖的优选方法。胞外多糖（EPS）的产量和结构特性受培养基和培养条件影响，然而其产量相对较低，限制了应用。近年来，研究者尝试通过物理场处理（如磁场）促进真菌生长和活性代谢物合成，但磁场对发酵产物化学结构的作用机制尚不明确。本研究旨在探究低频交变磁场（LF-AMF）辅助液体发酵对金顶侧耳EPS结构特征和生物合成的影响，为磁调控食用菌多糖生产提供理论依据。

**研究人员开展的研究与结论**
研究人员将LF-AMF（50 Hz正弦波，强度40 Gs，处理6小时）应用于金顶侧耳液体发酵，提取并纯化EPS，通过化学和光谱方法分析其结构，并利用转录组学解析分子机制。结果表明：LF-AMF辅助发酵改变了EPS的类型（仅产生一种POL3，而非发酵对照组两种POL1和POL2），单糖组成、摩尔比及分子量均发生显著变化；LF-AMF增强了EPS的热稳定性和絮凝活性，且乳化活性与对照组相当；转录组分析共鉴定出32,413个差异表达基因（DEGs），其中糖酵解和TCA循环相关基因上调。该研究证实LF-AMF通过调控糖酵解途径影响EPS生物合成前体供应，从而改变EPS的结构与理化特性。论文发表在《*Foods*》期刊。

**主要关键技术方法**
1. **LF-AMF装置与处理**：使用定制低频交变磁场摇床系统（220 V交流供电，TDGC2-3k调压器），50 Hz正弦波，强度40 Gs，方向垂直于液面，处理时间6小时，发酵温度28.3±0.5°C。
2. **EPS提取纯化**：发酵液经乙醇沉淀、三氯乙酸（TCA）脱蛋白、透析后得粗多糖（C-EPS），再经DEAE-52阴离子交换柱（水及0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl梯度洗脱）和Sephadex G-150凝胶柱纯化，获得纯化EPS（P-EPS）。
3. **结构表征**：紫外光谱（UV）检测核酸/蛋白残留；傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析官能团；气相色谱（GC）测定单糖组成；高效凝胶渗透色谱（HPGPC）测定分子量；刚果红实验分析三股螺旋构象；热重分析（TGA）和差示扫描量热法（DSC）评估热稳定性。
4. **功能分析**：乳化活性（以十六烷为油相，测定540 nm吸光度）；絮凝活性（以活性炭悬液为底物，测定550 nm吸光度）。
5. **转录组分析**：样本来源为金顶侧耳菌株CICC 14010（中国工业菌种保藏中心，江苏大学保藏）。使用Trizol提取RNA，NovaSeq 6000平台测序，Trinity软件组装，DESeq2筛选DEGs（|log₂ fold change| ≥ 1，校正p < 0.05），并进行GO和KEGG富集分析。

**研究结果**
3.1 **EPS的纯化**：正常发酵获得两种EPS（POL1和POL2），LF-AMF辅助发酵仅获得一种EPS（POL3），表明LF-AMF改变了EPS分泌类型。
3.2 **EPS结构分析**
- 3.2.1 UV光谱：POL1、POL2和POL3在260 nm和280 nm处无吸收峰，不含核酸和蛋白质。
- 3.2.2 FT-IR光谱：三种EPS均含典型多糖官能团（-OH、C-H、C=O、C-O-C等），属吡喃糖结构；POL1和POL3存在β-D-吡喃葡萄糖苷键和α-糖苷键，POL2存在α-糖苷键。
- 3.2.3 单糖组成：POL1由果糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以摩尔比4.72:2.81:2.21:0.41组成；POL2由鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以1.33:1.95:2.33:1.27组成；POL3由果糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖以21.58:1.96:5.87:1.96:0.56组成。LF-AMF改变了单糖组成。
- 3.2.4 分子量：POL3分子量（1.456×10⁴ Da）大于POL1（1.439×10⁴ Da）和POL2（2.003×10³ Da），LF-AMF提高了EPS分子量。
- 3.2.5 三股螺旋构象：刚果红实验显示三种EPS在NaOH浓度0.3 mol/L时最大吸收波长发生红移，均存在三股螺旋构象，但高浓度NaOH下构象被破坏。
3.3 **EPS功能特性**
- 3.3.1 热特性：DSC显示POL3的吸热峰温度最高，结合水能力最强；TGA显示POL3在30–100°C失重率最低（约30%），热稳定性增强。
- 3.3.2 乳化活性：LF-AMF辅助发酵EPS的乳化活性与对照组无显著差异（30 min约71.35% vs 71.21%），稳定性良好，但低于黄原胶。
- 3.3.3 絮凝活性：EPS浓度在0.2–0.6 mg/mL时絮凝活性随浓度增加而升高，0.6 mg/mL时达最大值（LF-AMF组61.53%，对照组59.90%），之后下降。LF-AMF组絮凝活性略高。
3.4 **转录组分析**
- 3.4.1 测序质量评估：各文库Q30碱基准确率>92%，GC含量正常，de novo组装获得54,465个转录本，N50为1485 bp，比对率>87.21%。
- 3.4.2 DEGs筛选：共鉴定32,413个DEGs，其中5,818个上调，26,595个下调，表明LF-AMF主要导致基因下调。
- 3.4.3 GO分析：DEGs主要富集于生物过程（细胞过程、代谢过程、生物调节）、细胞组分（细胞解剖实体、细胞内）和分子功能（结合、催化活性）。
- 3.4.4 KEGG通路分析：DEGs参与132条通路，最多为代谢途径（2250个）、次生代谢物生物合成（1080个）、核糖体（477个）。显著富集通路包括核糖体、光合作用、内吞作用等。
- 3.4.5 中心碳与能量代谢网络：糖酵解/糖异生通路中161个DEGs，己糖激酶（2.7.1.1）、6-磷酸果糖激酶（2.7.1.11）、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（4.1.2.13）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（1.2.1.12）等上调，葡萄糖-6-磷酸异构酶（5.3.1.9）下调，促进果糖-1,6-二磷酸积累，加速糖酵解。TCA循环中柠檬酸合酶（2.3.3.1）、异柠檬酸脱氢酶（1.1.1.42）和α-酮戊二酸脱氢酶（1.8.1.4）上调，增强能量代谢，为EPS合成提供前体。

**总结与结论**
本研究表明，LF-AMF通过上调糖酵解和TCA循环关键酶基因（如己糖激酶、6-磷酸果糖激酶、柠檬酸合酶等），改变代谢流，影响EPS生物合成前体（如核苷酸糖）的供应，导致EPS结构（单糖组成、分子量、热稳定性）和功能（絮凝活性）发生变化。研究结论为：LF-AMF辅助发酵改变了金顶侧耳EPS的类型和结构特性，提高了热稳定性和絮凝活性，同时保持乳化活性；转录组分析揭示了LF-AMF对糖酵解和TCA循环的调控作用。未来研究应聚焦于LF-AMF生产EPS的生物活性（如降血糖、抗肿瘤、抗炎等），以促进其应用并提升经济价值。