N-乙酰半胱氨酸、替龙及其组合：体外抗氧化与抗炎活性及其在乙酸诱导溃疡性结肠炎大鼠模型中的保护作用

《International Journal of Molecular Sciences》：N-Acetylcysteine, Tiron, and Their Combination: In Vitro Antioxidant and Anti-Inflammatory Activities and Their Protective Effect in a Rat Model of Acetic Acid-Induced Ulcerative Colitis

　　

溃疡性结肠炎以炎症、氧化应激和过量自由基产生为特征。本研究探讨了N-乙酰半胱氨酸（NAC）、替龙（Tiron）及其固定比例组合在乙酸诱导结肠炎中的抗氧化、抗炎及保护作用。研究采用整合策略，结合配体-配体分子对接、无细胞抗氧化和蛋白质变性抑制试验，以及雄性Wistar大鼠体内模型。通过腹腔内预处理NAC、Tiron或NAC-Tiron 14天后，以直肠内给予3%乙酸诱导结肠炎。分子对接分析提示，二者通过非共价相互作用具有理化相容性。体外实验中，NAC、Tiron及其组合均表现出抗氧化和抗蛋白质变性活性。在部分检测终点，NAC-Tiron的活性高于单一化合物，尤其在2,2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）自由基清除方面，但在其他检测中并未持续优于单一药物。体内实验中，NAC、Tiron及NAC-Tiron减轻了肉眼及组织学结肠损伤，减少炎性细胞浸润和水肿，降低脂质过氧化和蛋白质羰基化，并有助于维持超氧化物歧化酶（SOD）活性、还原型谷胱甘肽（GSH）和总硫醇水平。各治疗组还减弱了C反应蛋白（CRP）和游离铁水平的升高，且未对所测系统性生化参数造成明显恶化。总体而言，这些发现为固定比例NAC-Tiron联合给药提供了探索性的概念验证，但尚未确立药理学协同作用或相对于标准疗法的优越性。

**N-乙酰半胱氨酸与Tiron联合治疗溃疡性结肠炎：一项整合式实验研究的系统解读**

**1. 研究背景与问题提出**

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）与克罗恩病同属炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD），是一种累及结肠黏膜的慢性、复发性、缓解与发作交替的炎性疾病。尽管目前已有糖皮质激素、氨基水杨酸制剂、免疫抑制剂及抗肿瘤坏死因子-α（TNF-α）生物制剂等可用于诱导和维持缓解，但长期使用常受限于高成本、应答丧失或耐药、激素依赖以及不良事件等问题。因此，探索能够支持黏膜保护、减轻氧化与炎症负担并降低复发风险的辅助或附加策略，具有重要临床意义。

UC的炎症过程涉及肠上皮屏障功能障碍、活性氧（ROS）过量产生、脂质与蛋白质氧化以及先天性和适应性免疫应答的持续激活。即使在临床缓解期，残留的内镜或组织学炎症仍可能持续存在，并与复发风险升高相关。实验性化学诱导结肠炎模型（包括大鼠乙酸诱导模型）可部分复现上述机制，表现为粒细胞浸润及多种氧化酶来源的ROS过量生成。同时，内源性抗氧化防御系统受损进一步加剧氧化还原失衡，导致蛋白质羰基化和脂质过氧化，丙二醛（MDA）水平升高。因此，氧化应激与炎症信号构成控制黏膜损伤和减轻慢性肠道炎症的相互关联靶点。

N-乙酰半胱氨酸（NAC）作为含硫醇的抗氧化剂和谷胱甘肽前体，已被广泛研究；Tiron（化学名为4,5-二羟基苯-1,3-二磺酸二钠）是一种高水溶性儿茶酚衍生物，具有金属螯合和自由基清除特性。二者均属化学结构明确的合成分子，通过部分不同且潜在互补的氧化还原相关机制发挥作用。本研究首次在实验性结肠炎中探索NAC与Tiron固定比例联合给药，目的是评估该组合相对于单一化合物的抗氧化、抗炎及保护效果，而非假定其具有药理学协同作用。

**2. 主要技术方法**
本研究采用整合式途径：首先通过配体-配体分子对接（AutoDock Vina）评估NAC与Tiron之间的理化兼容性；随后运用系列无细胞试验检测自由基清除能力，包括ABTS和DPPH法、亚铁离子螯合能力、铁还原抗氧化能力以及蛋白质变性抑制试验（以BSA为底物，双氯芬酸为阳性对照）；最后建立乙酸诱导的雄性Wistar大鼠溃疡性结肠炎模型（购自突尼斯巴斯德研究所），随机分为6组（每组6只），以腹腔注射方式分别给予NAC（100 mg/kg）、Tiron（100 mg/kg）或NAC-Tiron固定1:1比例组合（总剂量100或200 mg/kg）预处理14天，随后直肠内给予3%乙酸诱导结肠炎，24小时后处死并采集样本。

**3. 研究结果**

**3.1 NAC-Tiron相互作用的分子模拟分析**
通过PubChem获取NAC和Tiron的三维结构并优化后，分子对接预测二者可通过氢键、静电相互作用和范德华力形成非共价接触。与NAC-高碘酸复合物相比，NAC-Tiron复合物具有更低的预测结合能和更有利的配体RMSD值，表明二者具有明确的相互作用几何构型，提示理化兼容。

**3.2 NAC、Tiron及其组合的体外抗氧化和抗变性活性**
ABTS法显示，NAC和Tiron单独使用在低浓度（5-10 μg/mL）时即具有与抗坏血酸相当的清除能力；NAC-Tiron组合在5-20 μg/mL浓度范围内表现出强效清除ABTS阳离子自由基的活性。DPPH法表明，NAC-Tiron组合的清除活性显著高于BHT标准品（p < 0.001），其IC₅₀为7.924 ± 0.783 μg/mL，显著低于NAC（38.985 ± 0.933 μg/mL）、Tiron（30.213 ± 1.614 μg/mL）和BHT（22.076 ± 4.233 μg/mL），但该效应未在其他抗氧化检测中持续显现。亚铁离子螯合试验中，Tiron在10 μg/mL时螯合率达82.782 ± 1.686%，接近EDTA的水平。铁还原试验中，三种制备物均显示出将Fe³⁺还原为Fe²⁺的能力。蛋白质变性抑制试验中，NAC的IC₅₀为0.733 ± 0.070 mg/mL，与双氯芬酸相当；NAC-Tiron组合的IC₅₀为2.114 ± 0.563 mg/mL，但并未优于NAC单独使用。

**3.3 NAC、Tiron及其组合减轻大鼠诱导性结肠炎**
在预处理阶段，所有大鼠体重均正常增长。结肠炎诱导后，模型组体重略有下降，而NAC-Tiron组合（100和200 mg/kg）预处理组体重未见下降。肉眼观察显示，结肠炎大鼠结肠明显发红增厚，湿结肠重量显著增加；各治疗组均减轻了这些病理表现，其中NAC-Tiron 200 mg/kg组显著降低了湿结肠重量（0.1901 ± 0.008 g/cm，p < 0.01 vs. 结肠炎组）。

**3.4 组织病理学保护作用**
结肠炎大鼠结肠表现为绒毛长度减少、炎性细胞聚集、水肿和上皮结构改变。NAC和Tiron预处理显示保留部分结肠组织学结构。NAC-Tiron两个剂量组均显示接近正常的结肠结构，上皮组织排列良好，炎性细胞浸润减少，绒毛结构和长度正常。组织学评分证实所有治疗组均较结肠炎组显著降低组织损伤（p < 0.001）。

**3.5 氧化应激调节作用**
结肠炎诱导显著升高了血浆和结肠组织中的MDA和蛋白质羰基水平。NAC、Tiron及NAC-Tiron各剂量组均显著降低了血浆MDA和蛋白质羰基水平（p < 0.001 vs. 结肠炎组）；结肠组织中，NAC及NAC-Tiron组合显著降低蛋白质羰基水平，Tiron单独使用未达显著效果。结肠炎还导致结肠SOD活性、总硫醇和GSH水平显著下降。Tiron及NAC-Tiron组合显著恢复SOD活性（p < 0.01）；各治疗组均显著恢复总硫醇和GSH水平（低剂量NAC-Tiron的GSH恢复未达统计学意义）。

**3.6 炎症和铁相关标志物的调控**
结肠炎大鼠血浆CRP、ALP活性和游离铁水平显著升高。NAC、Tiron及两种剂量的NAC-Tiron均显著降低了CRP水平（p < 0.01 ~ p < 0.001）；NAC-Tiron 200 mg/kg组CRP降至与对照组相当的水平（1.061 ± 0.184 mg/dL）。各治疗组均不同程度降低了ALP活性。对于血浆游离铁，NAC-Tiron两种剂量均将其降至接近对照组水平（p < 0.001）。结肠炎还增加了结肠匀浆中甘油-3-磷酸脱磷酸化活性（以无机磷释放量反映），各治疗组均显著抑制了该活性。

**3.7 肝功能与系统生化指标的改善**
结肠炎显著升高了血浆AST、ALT、LDH和γ-GT活性。NAC、Tiron及NAC-Tiron各剂量组均不同程度抑制了这些酶活性的升高，其中NAC-Tiron 200 mg/kg组将ALT恢复至参考范围内（44.800 ± 6.265 IU/L，p < 0.001）。代谢指标分析显示各组间无明显异常改变，血糖、甘油三酯、胆固醇、甘油和肌酐虽部分组间有统计学差异，但均处于预期参考范围内。

**4. 讨论与结论总结**
NAC和Tiron虽均为抗氧化分子，但其化学性质不同：NAC是含硫醇的谷胱甘肽前体，Tiron是具金属螯合性的儿茶酚衍生物。分子对接显示二者可通过非共价相互作用共存，且保持参与氧化还原反应的结构特征。体外结果支持NAC-Tiron在DPPH清除方面具有较强活性，但因未经正式药理学相互作用分析，不能据此判定协同效应。体内实验中，NAC-Tiron在减轻结肠损伤、降低氧化应激指标、恢复内源性抗氧化防御以及抑制炎症标志物方面均表现出积极作用。研究还发现血游离铁的降低与体外铁螯合活性一致，提示限制铁相关氧化反应可能是其保护机制之一，但未直接测定铁死亡、细胞因子和炎症信号通路标志物，因此应谨慎解释。需要特别指出，本研究存在若干局限：缺少标准药物阳性对照、仅考察单一1:1固定比例且未设置等剂量单药匹配组、研究对象为短期预防方案且仅用雄性大鼠、未进行药代动力学和药物相互作用研究。因此，NAC-Tiron联合给药在部分检测终点显示增强效应，但并不构成药理学协同或对标准疗法的优越性证据。

结论：本研究通过计算机模拟、体外试验和体内模型的整合评估，首次探索了NAC与Tiron固定比例联合在乙酸诱导结肠炎中的作用。14天预处理可减轻宏观和组织学结肠损伤，降低氧化损伤标志物，有助于维持内源性抗氧化防御（SOD活性、硫醇水平、GSH含量），并减轻CRP和游离铁的升高，且未观察到明显系统性生化异常。该研究的创新点在于对固定1:1比例NAC-Tiron联合方案的探索性评估，而非单一化合物的效果。未来需要包括多种剂量比例、匹配的单一药物低剂量组、标准治疗对照以及专门的药理学相互作用分析，以进一步明确该组合的临床应用潜力。