硼酸类蛋白酶体抑制剂中去质子化路径的热力学偏好：来自密度泛函理论研究的见解

《Pharmaceuticals》：Thermodynamic Preference Between Deprotonation Pathways in Boronic Acid-Based Proteasome Inhibitors: Insights from a DFT Study

　　

背景/目的：硼酸类蛋白酶体抑制剂（BABPIs），包括Bortezomib、Ixazomib和Delanzomib，是临床相关的抗癌药物，其作用机制依赖于硼酸弹头（warhead）与首位苏氨酸残基（Thr1）的直接相互作用，形成共价四面体复合物。尽管该复合物的形成已被充分研究，但硼酸弹头后续行为，特别是两个硼羟基之一去质子化形成单阴离子硼酸盐物种的可能性，仍未被探索。因此，本研究探讨Thr1-OH与单阴离子硼酸盐物种的形成是否在热力学上有利，以及两个羟基中哪一个更易去质子化。方法：采用B3LYP/6-311+G(d,p)水平的密度泛函理论（DFT）计算，结合极化连续介质模型（PCM），研究抑制剂及简化弹头模型的两条竞争去质子化路径。为模拟蛋白酶体环境，反应在二乙醚（ε=4）、甲醇（ε=33）和水（ε=78）等不同极性介质中建模。结果：DFT计算确认共价四面体复合物可转化为Thr1-OH与单阴离子硼酸盐物种，即一个硼羟基去质子化。对所有抑制剂而言，路径1去质子化比路径2更有利，尤其在极性溶剂中。Bortezomib表现出对-OH1去质子化的强烈偏好，??G≈?7 kcal·mol?1。相比之下，Ixazomib、Delanzomib及简化弹头模型的??G值较小（≈?2 kcal·mol?1），处于方法不确定度（±2 kcal·mol?1）内，提示生理条件下两种去质子化模式并存。结论：结果为BABPIs去质子化行为提供了比较热力学见解，表明去质子化过程中两个羟基并不等价。该发现提供了物理化学框架，可支持下一代BABPIs的合理设计。

研究背景与问题提出：蛋白酶体是泛素介导细胞内蛋白水解的核心酶复合体，其20S催化亚基的N端亲核苏氨酸（Thr1）负责对底物肽键的亲核进攻。硼酸类蛋白酶体抑制剂（BABPIs）如Bortezomib、Ixazomib、Delanzomib通过硼酸弹头与Thr1-O^?形成共价四面体硼酸酯复合物而发挥抗肿瘤作用。已有研究多聚焦于该复合物的形成，但复合物后续是否可重排为Thr1-OH与单阴离子硼酸盐物种、两个硼羟基（OH₁与OH₂）在去质子化上的热力学优劣及溶剂影响均属空白。鉴于去质子化状态可能关联抑制剂可逆性与释放机制，研究人员在《Pharmaceuticals》发表上述DFT研究，以明确该转化可行性及位点偏好。

主要关键技术方法：研究人员使用Gaussian 16程序，在B3LYP/6-311+G(d,p)水平结合极化连续介质模型（PCM）进行几何优化与频率分析，确认驻点无虚频；以孤立去质子化Thr1-O^?片段模拟催化残基，构建方程(1) OH₁去质子化与方程(2) OH₂去质子化两条路径；在气相及二乙醚（ε≈4）、甲醇（ε=33）、水（ε=78）三种连续介质中计算Gibbs自由能变（?G）与路径差（??G=?G_OH1??G_OH2）；以晶体键长校验几何可靠性，并以3-21G*、6-31+G(d,p)、M06-2X等做基准测试。

研究结果：

2.1 研究抑制剂的优化几何：Bortezomib、Ixazomib、Delanzomib及简化弹头模型在PCM水相下优化，硼酸弹头B-O键约1.37 ?，B-C约1.59–1.60 ?，肽骨架C=O与N-C与晶体偏差≤0.065 ?，证实计算协议可靠。

2.2 计算协议的结构验证：键长对比晶体数据误差0.005–0.065 ?，基准计算显示自由能对基组与泛函不敏感，B3LYP/6-311+G(d,p)适用。

2.3 研究抑制剂的溶剂化分析：相对溶剂化自由能随极性增大而稳定化增强，水相中Bortezomib最稳（?G⁷⁸=?18.01 kcal·mol^?1），简化模型最弱（?12.07 kcal·mol^?1）；二乙醚中稳定化比水相低4.5–5.5 kcal·mol^?1。

2.4 硼羟基质子转移的热力学可行性：

2.4.1 路径1（OH₁去质子化）：所有分子在所有介质中?G均为负（?35.27至?15.53 kcal·mol^?1）；水相中Bortezomib最有利（?G⁷⁸=?22.61），简化模型与Delanzomib接近。

2.4.2 路径2（OH₂去质子化）：同样全为负值；水相中Ixazomib最有利（?16.08），Bortezomib为?14.98，各分子较路径1绝对值略小。

2.4.3 两路径比较：??G均负向，极性溶剂中OH₁偏好更明；Bortezomib在甲醇/水??G约?7.2至?7.6 kcal·mol^?1，二乙醚微正（+0.53，在误差内）；Ixazomib、Delanzomib、简化模型??G仅?1.3至?2.06，属方法不确定度内，提示两路径共存。

2.5 研究局限：未含完整活性位氨基酸、氢键网与显式水；PCM连续介质无法还原异质蛋白环境；未算过渡态与动力学；结果为简化条件下比较趋势。

讨论与结论翻译：蛋白酶体抑制已是癌症治疗确证策略，BABPIs硼酸弹头与Thr1形成四面体硼酸酯复合物是关键步，但弹头去质子化行为未明。本DFT研究表明，质子从BABPIs转移至Thr1-O^?在各极性介质均热力学有利；硼羟基具去质子化能力，OH₁路径整体占优。Bortezomib在甲醇/水??G超7 kcal·mol^?1明确偏好OH₁；Ixazomib、Delanzomib及简化模型??G仅1.3–2.06 kcal·mol^?1，在DFT误差（±2）内，两路径可能并存。OH₁偏好受弹头局部几何、溶剂稳定化及去质子物种稳定化共同影响，但本研究未做定量分解。综上，比较DFT分析揭示硼酸弹头两羟基化学非等价，分子骨架可调控去质子化路径，为下一代BABPIs设计提供热力学框架。