《Biomolecules》：miRNA484 and miRNA335-5p as Potential Diagnostic Biomarkers for CA19-9-Negative Pancreatic Ductal Adenocarcinoma
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胰腺导管腺癌（PDAC）是全世界最致命的癌症之一，主要原因是诊断较晚。诊断通常依赖影像学和活检，但仅在肿瘤进展后才进行，这降低了治疗效果。目前的生化生物标志物仅限于CA19-9，它更适用于预后和监测而非诊断。循环miRNA可能为PDAC诊断提供微创的补充生物标
胰腺导管腺癌（PDAC）是全世界最致命的癌症之一，主要原因是诊断较晚。诊断通常依赖影像学和活检，但仅在肿瘤进展后才进行，这降低了治疗效果。目前的生化生物标志物仅限于CA19-9，它更适用于预后和监测而非诊断。循环miRNA可能为PDAC诊断提供微创的补充生物标志物，并可能考虑种族和治疗相关变量。研究人员对5例非转移期和5例转移期PDAC患者以及10例健康对照者的血浆进行了小RNA测序，以生成探索性miRNA谱。随后，通过RT-qPCR在由70例PDAC患者和106例健康对照者组成的独立队列中对候选miRNA进行了验证，9种miRNA显示出有前景的差异血浆表达。值得注意的是，miRNA484和miRNA335-5p与CA19-9阴性患者的PDAC相关，其受试者工作特征曲线下面积（ROC AUC）分别为0.984和0.88。总体而言，这些结果表明miRNA484和miRNA335-5p作为CA19-9阴性PDAC患者的补充生物标志物可能具有临床价值。
**研究背景与目的**
胰腺导管腺癌（PDAC）是全球最具侵袭性和致死性的恶性肿瘤之一，2022年新发病例近51万例，死亡46.7万例，5年生存率极低（美国2015-2021年为13.3%）。诊断主要依赖影像学和活检，但多数患者确诊时已处于晚期，治疗窗口有限。当前最常用的生化标志物CA19-9在诊断中敏感性和特异性不足，且约5-10%的群体因Lewis抗原阴性而无法合成CA19-9，导致大量PDAC患者（包括转移性和非转移性）呈现CA19-9阴性，产生假阴性结果。因此，寻找互补的生物标志物以弥补CA19-9的局限性是临床迫切需求。循环miRNA（微小核糖核酸，~20-25核苷酸的非编码RNA）在体液中稳定存在，可调控mRNA翻译并影响肿瘤进程，具备作为微创诊断标志物的潜力。本研究旨在通过血浆miRNA测序和验证，识别具有诊断价值的差异表达miRNA，特别关注CA19-9阴性PDAC患者。
**研究内容与结论**
研究人员对巴西圣保罗癌症研究所（ICESP）和库里蒂巴工人医院（Hospital do Trabalhador）的70例PDAC患者和106例健康对照者进行了血浆miRNA分析。首先通过小RNA测序（发现阶段，5例非转移期、5例转移期PDAC患者及10例对照）筛选差异表达miRNA，随后在独立验证队列中用RT-qPCR（实时定量聚合酶链反应）验证，最终鉴定出9种诊断潜力miRNA（ROC AUC >0.90）。其中，miRNA484和miRNA335-5p在CA19-9阴性和阳性患者中均表现一致，ROC AUC分别为0.984和0.88，提示其可作为CA19-9阴性PDAC的补充筛查标志物。该研究发表于《Biomolecules》，为PDAC诊断提供了新的候选分子。
**主要关键技术方法**
研究采用前瞻性病例-对照设计，样本来源于巴西两家机构（ICESP和Hospital do Trabalhador）。发现阶段使用miRNeasy试剂盒提取血浆总RNA，通过Illumina TruSeq小RNA文库制备和HiSeq 2500测序（单端50 bp）获得miRNA表达谱，数据经ACGT101 miR流程和DESeq2进行差异表达分析（p<0.05，|FC|≥2）。验证阶段采用MagMAX mirVana Total RNA Isolation Kit提取血浆RNA，以外源cel-miRNA39-3p作为归一化内参，使用TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit和QuantStudio 5实时PCR系统进行RT-qPCR定量，相对表达量通过2
-ΔΔCT法计算，ROC曲线评估诊断效能。
**研究结果**
**3.1 发现阶段**
- **3.1.1 队列描述**：10例初治PDAC患者（5例非转移期、5例转移期），年龄35-84岁，男女各半；肿瘤分布：头部69.8%、体部22.6%、尾部7.6%。健康对照组10例，年龄性别匹配。
- **3.1.2 RNA测序**：非转移期PDAC vs 对照差异表达miRNA 93个（8上调、85下调），转移期PDAC vs 对照差异表达271个（25上调、246下调）。其中69个miRNA在两组中均差异表达，24个仅见于非转移期，202个仅见于转移期。
**3.2 RT-qPCR验证**
- 从22个候选miRNA中验证出21个在PDAC与对照间差异表达，其中9个miRNA（miRNA361-5p、miRNA409-3p、miRNA126-5p、miRNA27b-3p、miRNA484、miRNA323b-3p、miRNA543、let7d-3p、miRNA335-5p）的ROC AUC>0.90，被选为诊断候选。
- 按CA19-9状态（阳性>37 U/mL，阴性<37 U/mL）分层分析后，miRNA484、miRNA335-5p、miRNA20b-5p和miRNA483-5p在CA19-9阴性组中仍显著差异表达，其中miRNA484和miRNA335-5p在两组中均表现高ROC AUC（0.984和0.88），提示其可作为CA19-9阴性PDAC的补充标志物。
**讨论与结论**
讨论部分指出，CA19-9阴性PDAC患者存在诊断空白，而miRNA484和miRNA335-5p在CA19-9阴性和阳性患者中均持续差异表达，可减少假阴性诊断。miRNA484在PDAC中常被报道为抑癌基因，其下调与YAP/TEAD（Yes相关蛋白/转录增强因子）和Wnt/MAPK（Wnt/丝裂原活化蛋白激酶）通路激活相关；miRNA335-5p亦为抑癌因子，恢复其表达可降低克隆形成、侵袭和转移能力，涉及OCT4（八聚体结合转录因子4）信号通路。研究局限性包括发现阶段样本量小、验证队列中部分患者分期信息缺失、缺乏慢性胰腺炎等疾病对照组，以及ROC指标可能因队列特异性而乐观。结论部分翻译如下：在本研究中，通过RNA测序进行的全面miRNA谱分析为在特征明确的队列中进行验证提供了靶点。研究人员在巴西患者中鉴定出9种具有PDAC诊断潜力的血浆miRNA，并发现4种miRNA在CA19-9阴性患者中显著改变，其中miRNA484和miRNA335-5p尤为突出，表明它们作为补充筛查标志物的前景。一个关键局限性是验证队列中PDAC样本相对较少，反映了招募早期、初治患者的困难；因此需要独立且更大规模的验证。需要更大规模、多中心、前瞻性和机制性研究，并严格控制多重检验和标准化前处理流程，以确认其临床效用。
