肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）生物膜形成能力与中国河南鸡源分离株抗菌耐药及毒力基因（2023–2025）的关联

《Antibiotics》：Associations of Biofilm Capacity with Antimicrobial Resistance and Virulence Genes in Klebsiella pneumoniae from Chickens in Henan, China, 2023–2025

　　

背景：肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一种机会性人兽共患病原体，可引起鸡呼吸道疫病。本研究旨在调查2023–2025年中国河南省鸡源肺炎克雷伯菌分离株的生物膜形成、耐药性与毒力特征，并分析这些性状间的关联。方法：研究人员通过血琼脂培养、革兰氏染色及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定分离株；采用拉丝试验（string test）评估高黏滞表型，结晶紫法测定生物膜形成能力，纸片扩散法检测抗菌药敏，聚合酶链反应（PCR）检测毒力基因。结果：共鉴定102株肺炎克雷伯菌，其中81.4%为生物膜形成株，15.7%呈现高黏滞表型。分离株对青霉素类耐药率>90.0%，对碳青霉烯类耐药率<10.0%，88.2%为多重耐药（MDR）。毒力基因检测显示luxS（79.4%）、mrkD（75.5%）和uge（73.5%）检出率最高，其次为wabG（49.0%）、ybtA（34.3%）和iucA（20.6%）。关联分析表明，生物膜形成与多重耐药及毒力基因携带显著相关；相较于非生物膜形成株，生物膜形成株对头孢噻呋（ceftiofur）和氟苯尼考（florfenicol）耐药率更高，且luxS、mrkD、uge检出率显著升高（p < 0.05）。结论：本研究揭示该病原体的致病潜能与多重耐药特征，凸显监测与监控的必要性。

研究背景与立项依据

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）属肠杆菌科，是重要机会性人兽共患病原体，既可致人类尿路、呼吸道及血流感染，也是鸡呼吸道疾病主要病原之一，国内鸡群分离率约9.0%–35.0%。其致病性依赖黏液黏度、脂多糖（LPS）、铁摄取系统及黏附素等毒力因子；由于有效疫苗缺位，临床防控高度依赖抗菌药物，而禽业不合理用药加速多重耐药（MDR）演化，给动物与人类健康均带来威胁。该菌尚可形成由菌体与胞外聚合物（EPS）构成的生物膜（biofilm），通过物理屏障与微环境改变增强免疫逃逸与药物耐受，导致慢性反复感染。既往江苏、山东、新疆等省鸡源菌株分子流行病学多聚焦单一维度（耐药、毒力或生物膜），三者联动分析有限；河南作为家禽养殖大省，区域流行病学数据尤其匮乏。鉴于生物膜在提升耐药与毒力中的枢纽作用，研究人员于2023–2025年系统采集河南病死鸡肝肺样本，开展生物膜—耐药—毒力三位一体关联研究，论文发表于《Antibiotics》。

主要技术方法概要

研究人员建立102株鸡源肺炎克雷伯菌非重复队列（每批次送检仅留一株，排除同群克隆干扰），经血琼脂分离、革兰氏染色初筛与MALDI-TOF MS种级鉴定；以拉丝试验（string test，拉丝>5 mm判高黏滞）表型复核，结晶紫微孔板法（OD₅₇₀，以2×空白OD为截点分强/中/弱/无生物膜）定量成膜能力；按CLSI M100/VET01S及T/ZNZ 099-2021用纸片扩散法测14类抗菌药物并定义MDR（对≥3类获得性耐药，氨苄西林因固有耐药不计入）；PCR靶向扩增luxS、uge、mrkD、fimH、iucA、iroB、rmpA、ybtA、wabG、wcaG十种毒力基因；卡方检验分析表型—基因型关联，p<0.05为显著。

研究结果

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   Results
   分离株于血琼脂呈圆凸光滑乳白菌落，革兰氏阴性短粗杆；MALDI-TOF确认102株，拉丝试验阳性16株（15.7%）。药敏显示青霉素类耐药>90.0%，碳青霉烯类<10.0%，31株耐7药、最广谱耐12药，总体MDR率88.2%（90/102）。结晶紫法示81.4%（83/102）成膜，其中强13.7%、中56.9%、弱10.8%、无18.6%。毒力基因中luxS（79.4%）、mrkD（75.5%）、uge（73.5%）高频，wabG（49.0%）、ybtA（34.3%）、iucA（20.6%）次之，rmpA（5.9%）、wcaG、fimH、iroB均≤17.6%。关联分析：16株高黏滞株全为MDR且皆具成膜能力，仅4株共携rmpA+iucA；成膜强度越高MDR比例越高，成膜株对头孢噻呋、氟苯尼考耐药率显著高于非成膜株（p<0.05）；成膜株luxS、mrkD、uge检出率显著更高（p<0.05）。

讨论部分总结

3.1节指出高黏滞表型未必由rmpA/iucA等高毒力基因驱动，染色体wzc突变亦可致黏度升高，且本队列中高黏滞株全部成膜，与Hyun等临床肝脓肿株结论呼应，提示rmpA阳性高黏株可能经mrkABCDF或CRP-cAMP、IscR调控逃逸胶囊对黏附的抑制。3.2节阐明luxS（群体感应）、mrkD（3型菌毛黏附素）、uge（LPS合成）分别参与成膜结构稳定、初始黏附与膜完整性，三者在成膜株显著富集，与跨宿主文献趋势一致。3.3节解释禽用头孢噻呋、氟苯尼考高频选用产生选择压，叠加生物膜外基质阻渗、外排泵与持留菌诱导，使成膜株对此两药耐药更突出；碳青霉烯仍高敏反映区域用药差异。文末自陈局限：缺全基因组分型难以排除优势克隆影响，PCR仅证存在不等同表达，后续需敲除回补与WGS补足。

结论翻译

2023–2025年河南鸡源肺炎克雷伯菌携带多样毒力因子且广泛MDR；虽rmpA、iucA等高毒力标记检出偏低，但luxS、mrkD、uge高流行与81.4%成膜率仍昭示明确致病潜能。关联分析确证成膜能力与毒力基因及抗菌耐药正向相关，成膜株对头孢噻呋、氟苯尼考耐药率及luxS/mrkD/uge检出率均显著高于非成膜株，提示此三基因在成膜与耐药增强中居关键地位。该研究为区域鸡源肺炎克雷伯菌感染防控、临床合理用药及抗生物膜策略开发提供理论与数据支撑。