《Molecules》：A Bioactivated Lepidium latifolium Formulation Disrupts Mitochondrial Bioenergetics and Metabolic Adaptation in KRAS-Mutant Cancer Cells
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胰腺导管腺癌（PDAC）和结直肠癌（CRC）是侵袭性恶性肿瘤，通常由致癌性Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）突变驱动，这些突变与代谢重编程和抗凋亡相关。在本研究中，研究人员评估了一种富含硫苷水解产物的Lepidium latifolium L.
胰腺导管腺癌（PDAC）和结直肠癌（CRC）是侵袭性恶性肿瘤，通常由致癌性Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）突变驱动，这些突变与代谢重编程和抗凋亡相关。在本研究中，研究人员评估了一种富含硫苷水解产物的Lepidium latifolium L.衍生制剂（CTP）在KRAS突变结直肠癌和胰腺癌模型中的抗肿瘤和抗炎活性。该制剂旨在通过铁依赖性黑芥子酶介导的芥子苷水解促进环硫腈1-cyano-2,3-epithiopropane（CETP）的生成。CTP在KRAS突变癌细胞系中诱导了剂量依赖性的细胞毒性和与凋亡一致的形态学改变。处理显著降低了线粒体膜电位、ATP生成、耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），表明严重的生物能量损伤。同时，CTP下调了代谢和增殖调节因子C-myc、PKM2、GLUT1和Cyclin E1。RNA-seq分析揭示了与氧化应激、代谢适应和细胞周期调节相关的广泛转录重编程。此外，CTP显著抑制了LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中一氧化氮、IL-6和IL-8的产生。这些发现表明，来自L. latifolium的硫苷衍生代谢物干扰了KRAS驱动的肿瘤存活所必需的代谢和炎症通路，并支持了十字花科来源的环硫腈作为多靶点抗癌药物的治疗潜力。
**研究背景、存在问题及研究目的**
胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）和结直肠癌（Colorectal cancer, CRC）是侵袭性极高的恶性肿瘤，其发病常与Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）的激活突变密切相关。KRAS突变驱动癌细胞发生代谢重编程（metabolic reprogramming），增强糖酵解、谷氨酰胺利用及线粒体可塑性，同时赋予细胞抗凋亡能力，导致对传统治疗的耐药性。尽管十字花科蔬菜（Brassicaceae）中硫苷（glucosinolate）的水解产物（如异硫氰酸酯）已被广泛研究其抗癌活性，但芥子苷（sinigrin）衍生的环硫腈（epithionitrile）——尤其是1-cyano-2,3-epithiopropane（CETP）——在KRAS突变肿瘤中的综合作用尚不明确。研究人员基于前期研究，开发了一种生物活化的Lepidium latifolium L.制剂（CTP），该制剂通过保留内源黑芥子酶（myrosinase）和铁离子辅因子，旨在促进胃肠道内原位生成CETP，从而克服CETP挥发性不稳定性问题。本研究旨在评估CTP在KRAS突变结直肠癌和胰腺癌细胞模型中的抗肿瘤和抗炎活性，并系统阐明其分子与代谢机制。该论文发表在《Molecules》。
**研究人员开展的研究与结论**
研究人员通过体外实验，在KRAS突变结直肠癌细胞系（SW480、DLD-1）和胰腺癌细胞系（MIA PaCa-2、PL45）中，系统评估了CTP的抗肿瘤活性；在LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中评估了其抗炎活性。主要结论包括：CTP浓度依赖性降低癌细胞活力并诱导凋亡形态变化；CTP显著抑制线粒体呼吸（耗氧率OCR降低）、糖酵解（细胞外酸化率ECAR降低）及ATP生成，导致生物能量崩溃；CTP下调关键代谢和增殖调节因子C-myc、PKM2、GLUT1和Cyclin E1的表达；RNA-seq揭示CTP诱导广泛的转录重编程，涉及氧化应激、代谢适应和细胞周期调控；CTP显著抑制一氧化氮（NO）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）的分泌。这些发现表明，CTP作为多靶点制剂，同时破坏KRAS驱动肿瘤的代谢适应和炎症微环境，具有重要的治疗潜力。
**主要关键技术方法**
1. **CTP制剂表征**：采用高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）定量芥子苷含量；液相色谱-高分辨质谱（LC-Orbitrap）鉴定黄酮类成分。
2. **细胞活力与形态学**：台盼蓝染色计数法检测SW480、DLD-1、MIA PaCa-2、PL45细胞活力，相差显微镜观察形态。
3. **生物能量代谢分析**：使用Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒实时测定耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）；JC-1染色检测线粒体膜电位（ΔΨm）；发光法测定细胞内ATP水平。
4. **蛋白表达分析**：Western blot检测C-myc、PKM2、GLUT1、Cyclin E1蛋白水平，以β-Actin为内参。
5. **转录组学分析**：对MIA PaCa-2细胞进行RNA-seq（Illumina NovaSeq 6000），使用edgeR进行差异表达分析。
6. **抗炎活性检测**：Griess法测定一氧化氮（NO）积累，ELISA检测IL-6和IL-8分泌。
**研究结果（保留各小标题）**
**2.1 化学表征**：通过HPLC-DAD定量，CTP制剂中芥子苷含量为33.52 mg g
-1；LC-Orbitrap鉴定出多种黄酮类化合物（总黄酮含量12.8 mg/100 mL），但本研究主要关注硫苷水解产物。
**2.2 对KRAS突变癌细胞活力的影响**：CTP（1-5 mg/mL）处理24 h后，SW480、DLD-1、MIA PaCa-2、PL45细胞活力呈浓度依赖性下降，并伴随细胞变圆、脱落等凋亡形态。SW480细胞敏感性最高，DLD-1相对较低。
**2.3 代谢和细胞周期调节蛋白的调控**：Western blot显示，CTP（1 mg/mL）处理24 h后，C-myc、PKM2、GLUT1和Cyclin E1蛋白表达水平在多数细胞系中显著下调，但不同细胞系间存在异质性。
**2.4 RNA-seq揭示转录重编程**：MIA PaCa-2细胞经CTP（5 mg/mL）处理24 h后，RNA-seq鉴定出2464个基因上调、837个基因下调。差异表达基因包括应激反应基因（HSPA6、HSPA7）、细胞周期调控因子（CDKN1A、CDC25A）及基质重塑相关基因（MMP10、HTRA3）。
**2.5 生物能量崩溃**：CTP（1 mg/mL）处理6 h后，所有细胞系的OCR和ECAR均显著降低；线粒体膜电位（ΔΨm）在DLD-1、MIA PaCa-2、PL45中下降，而SW480未降低；ATP水平在所有细胞系中均显著下降，表明CTP同时抑制线粒体呼吸和糖酵解，导致生物能量崩溃。
**2.6 抗炎活性**：在LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中，CTP（1-5 mg/mL）浓度依赖性抑制一氧化氮（NO）积累、IL-6和IL-8分泌，在5 mg/mL时效果最强。
**讨论与结论**
讨论部分指出，CTP制剂的抗肿瘤和抗炎活性源于其多靶点机制：通过铁依赖性黑芥子酶水解芥子苷，生成CETP等环硫腈类代谢物，同时破坏线粒体功能、糖酵解、增殖信号通路及炎症介质释放。与以往主要研究异硫氰酸酯不同，本研究首次系统表征了环硫腈富集制剂在KRAS突变肿瘤模型中的作用。CTP对氧化应激和代谢适应同时施加压力，使依赖线粒体代谢的胰腺癌细胞尤为敏感。此外，CTP在巨噬细胞中抑制炎症因子，有助于改善肿瘤微环境。局限性在于CTP为完整制剂，有效代谢物浓度低于名义浓度，需进一步量化体内代谢物。研究结论翻译如下：**本研究表明，源自Lepidium latifolium的硫苷基制剂CTP，通过受控的芥子苷生物活化富集生物活性含硫代谢物，在KRAS突变结直肠癌和胰腺癌模型中发挥显著的抗肿瘤和抗炎活性。CTP降低癌细胞活力，损害线粒体功能和细胞生物能量学，下调关键代谢和增殖调节因子（包括C-myc、PKM2、GLUT1和Cyclin E1），并诱导与氧化应激、代谢适应和细胞周期调控相关的广泛转录重编程。此外，CTP显著抑制活化巨噬细胞中炎症介质的产生，支持其双重抗肿瘤和抗炎作用模式。综上，CTP是一种化学表征的多靶点制剂，能够利用致癌KRAS信号相关的代谢脆弱性。需要进一步研究表征单个硫苷衍生代谢物的具体贡献，在额外临床前模型中验证这些效应，并探索该制剂作为KRAS驱动恶性肿瘤辅助策略的转化潜力。**
