区域性医疗网络中产NDM和OXA-48类似物共产肺炎克雷伯菌的出现与传播：来自意大利拉齐奥大区的七年监测

《Antibiotics》：Emergence and Dissemination of NDM+OXA-48-like Co-Producing Klebsiella pneumoniae in a Regional Healthcare Network: Seven-Year Surveillance from Latium, Italy

　　

背景：脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）是最具临床重要性的厌氧菌，其由cfiA金属-β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase）介导的碳青霉烯耐药性日益增加。尽管插入序列（insertion sequence，IS）介导的cfiA激活是公认的机制，但IS非依赖性基因组机制的贡献仍未完全阐明。本研究调查了来自韩国的临床脆弱拟杆菌分离株中cfiA相关碳青霉烯耐药的表型和基因组机制。方法：于2022年至2023年间从韩国三家医疗机构收集了26株非重复碳青霉烯不敏感脆弱拟杆菌分离株。采用纸片扩散法和琼脂稀释法检测抗菌药物敏感性，并使用厌氧碳青霉烯灭活法（anaerobic carbapenem inactivation method，Ana-CIM）和美罗培南双端Etest评估碳青霉烯酶活性。进行全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）以鉴定耐药决定因子、插入序列、启动子结构和多位点序列类型（multilocus sequence types，MLST）。结果：26株分离株中，12株（46.2%）为cfiA阳性，14株（53.8%）为cfiA阴性。在4株携带cfiA上游激活型IS元件（IS1187或IS942）的cfiA阳性分离株中观察到高水平耐药（亚胺培南最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）≥32 mg/L；美罗培南MIC≥128 mg/L）。值得注意的是，另有3株高水平耐药cfiA阳性分离株缺乏上游IS元件，并表现出不同的基因组特征，包括cfiA₂串联重复（SEV23_101）、cfiA₁₄上游重复启动子结构（SEV23_15），以及与cfiA₁₈相关的高水平耐药（SCL22_40）。Ana-CIM仅在美罗培南MIC≥128 mg/L的分离株中呈阳性，而美罗培南双端Etest未能区分cfiA相关的碳青霉烯酶活性。结论：这些发现表明，脆弱拟杆菌的高水平碳青霉烯耐药可能与多种基因组特征相关，包括IS介导的激活、cfiA基因拷贝数增加和启动子扩增。因此，分子特征分析对于准确解读脆弱拟杆菌的碳青霉烯耐药性至关重要。

脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）是临床上最重要的厌氧革兰阴性杆菌，常引起腹腔感染、血流感染、脓肿及其他深部感染。碳青霉烯类抗生素是治疗多重耐药B. fragilis的关键药物，但近年碳青霉烯耐药率上升，且与30天死亡率增加相关。B. fragilis的碳青霉烯耐药主要取决于染色体编码的金属-β-内酰胺酶基因cfiA，该基因存在于II型菌株中，而I型菌株不含cfiA。然而，仅有cfiA并不足以导致耐药，通常需要上游插入序列（insertion sequence，IS）提供强启动子来激活cfiA表达。这一经典IS激活模型无法解释全部耐药表型，例如无IS的cfiA阳性菌株MIC升高、cfiA阴性菌株亦出现碳青霉烯不敏感等情况。因此，需要系统解析表型与基因组的对应关系，以准确判断耐药机制并指导治疗。

本研究由研究人员开展，旨在表征碳青霉烯不敏感B. fragilis临床分离株的表型和基因组特征，重点关注cfiA激活的IS依赖及IS非依赖机制。研究人员自2022年1月至2023年12月从韩国三家医疗机构（汉阳大学医院、Severance医院和首尔临床实验室）收集了26株非重复碳青霉烯不敏感B. fragilis临床分离株，其中9株来自血液、9株来自脓肿、8株来自体液。通过全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）联合表型药敏试验和碳青霉烯酶活性检测，系统分析了耐药决定因子、IS元件、启动子结构及多位点序列类型（multilocus sequence types，MLST）。

在技术方法上，研究人员采用了基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）进行菌种鉴定和cfiA预测；采用纸片扩散法（disk diffusion test，DDT）和琼脂稀释法（agar dilution method，ADM）测定亚胺培南和美罗培南的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）；采用厌氧碳青霉烯灭活法（anaerobic carbapenem inactivation method，Ana-CIM）和美罗培南双端Etest评估碳青霉烯酶活性；对全部26株菌进行Illumina NovaSeq 6000全基因组测序，分析耐药基因、IS、启动子结构、MLST及cfiA周围基因组结构。基因组草图已提交至NCBI（BioProject登录号PRJNA1499346）。

研究结果按照原文小标题总结如下。

2.1 B. fragilis分离株及药敏特性：通过WGS确认12株（46.2%）为cfiA阳性（II型），14株（53.8%）为cfiA阴性（I型）。7株cfiA阳性分离株呈高水平耐药，美罗培南MIC为128 mg/L至>256 mg/L，亚胺培南MIC为32 mg/L至128 mg/L。表型高度异质性：两株cfiA阳性分离株美罗培南MIC仅为4 mg/L，而两株cfiA阴性分离株美罗培南MIC≥16 mg/L。这一结果说明cfiA携带状态与耐药水平并非简单对应。

2.2 基于MALDI-TOF MS、Ana-CIM和美罗培南双端Etest的金属-β-内酰胺酶活性检测：MALDI-TOF MS正确预测了全部12株cfiA阳性分离株，但有一株cfiA阴性分离株被误判为阳性，总体与WGS的一致率为96.2%（25/26）。Ana-CIM仅在高水平耐药（美罗培南MIC≥128 mg/L）的7株分离株中呈阳性，表明该法检测的是具有表型意义的碳青霉烯酶活性，而非单纯的cfiA存在。美罗培南双端Etest在重复检测中均无法有效区分cfiA相关的碳青霉烯酶活性，按制造商标准25/26株被判定为阳性，说明该法对B. fragilis的适用性较差。

2.3 耐药相关基因：MLST显示分离株遗传多样性丰富，cfiA阳性组中ST157最常见（4/12，33.3%）。4株cfiA阳性分离株在cfiA上游携带激活型IS元件（IS1187或IS942），均呈高水平耐药，符合经典IS介导激活模型。然而，另有3株无上游IS元件的高水平耐药菌株表现出独特的基因组结构：SEV23_101含两个串联重复的cfiA₂拷贝，提示基因剂量增加可能是耐药机制；SEV23_15在cfiA₁₄上游存在两个预测的启动子样基序，提示启动子重复；SCL22_40携带cfiA₁₈，既无上游IS也无启动子重复，其耐药机制尚不明确。对所有无IS的cfiA阳性分离株的cfiA上游区域进行比对，均检测到与Bacteroides启动子保守序列一致的基序，但这些菌株的美罗培南MIC从4 mg/L到>256 mg/L不等，说明保守启动子序列本身不足以解释耐药水平。

讨论部分总结了研究的核心发现和临床意义。研究证实，B. fragilis的高水平碳青霉烯耐药既可由IS介导的cfiA激活引起，也可能与cfiA串联重复导致的基因拷贝数增加、启动子结构重复等IS非依赖机制有关。然而，每个非IS机制均仅在单一菌株中观察到，且未进行转录水平和功能学验证，因此这些发现应被视为潜在关联而非确定的耐药机制。在cfiA阴性分离株中，两株（SCL23_30和SCL22_13）通过WGS检出blaOXA-347基因，该获得性D类β-内酰胺酶可能经高表达介导碳青霉烯耐药；另一株（SEV23_98）未检出已知耐药基因，其耐药或涉及非酶机制或现有数据库未覆盖的决定因子。现有表型检测方法各有限制：MALDI-TOF MS可快速筛查cfiA携带但需分子确认；Ana-CIM只能识别高活性碳青霉烯酶；美罗培南双端Etest在该菌种中无法判别金属-β-内酰胺酶。因此，单纯依赖表型方法难以准确推断cfiA携带或激活状态，结合常规药敏、快速筛查和靶向分子确认可能更有利于临床实验室解读。

结论部分翻译如下：B. fragilis的高水平碳青霉烯耐药在某些分离株中与IS介导的cfiA激活相关，而其他分离株则显示出非IS依赖的基因组特征，包括cfiA串联重复和启动子结构重复。然而，每个提出的非IS机制仅在一个分离株中观察到，且未进行转录或功能验证。因此，这些发现应被视为潜在关联而非确定的耐药机制。单独的表型方法无法可靠预测cfiA携带或激活状态。将常规药敏检测、快速筛查和靶向分子确认相结合，可能改善临床实验室的解读。需要进行更大规模的多中心研究和功能分析，以确定这些非经典基因组特征的流行率、表达效应和临床意义。

该研究通过全基因组测序与表型检测的整合分析，揭示了B. fragilis碳青霉烯耐药中以往被忽视的IS非依赖基因组机制，强调了分子特征分析在临床微生物学耐药解读中的关键作用。相关成果发表于《Antibiotics》。