肾蕨总黄酮和粗多糖的提取工艺优化及其体外抗氧化活性评估

《Molecules》：Optimization of Extraction Process for Total Flavonoids and Crude Polysaccharides from Nephrolepis cordifolia and Assessment of Their In Vitro Antioxidant Properties

　　

本研究系统优化了肾蕨(Nephrolepis cordifolia (L.) C. Presl)干燥地下块茎中两种生物活性成分——总黄酮和粗多糖的提取工艺，并进一步全面表征了其体外抗氧化活性。在总黄酮提取方面，将乙醇-硫酸铵双水相体系(ATPS)与超声辅助双水相提取(UATPE)相结合，以总黄酮含量(TFC)为主要响应指标，采用基于Box-Behnken设计的响应面法(RSM)对工艺参数进行优化。经验证的最佳条件确定为：提取时间40.67 min，料液比1:30.71 (g/mL)，硫酸铵质量分数24.03%，乙醇浓度35% (v/v)。在此优化条件下，TFC达到(54.83±1.58) mg芦丁当量/克干重(mg RE/g DW)，显著高于传统ATPS[(49.05±0.41) mg RE/g DW]和传统乙醇提取[(28.68±1.54) mg RE/g DW]所得值(p < 0.05)。在粗多糖制备方面，采用超声辅助水提-醇沉方案，通过L9(3³)正交实验设计筛选参数。获得的最佳提取参数为提取时间10 min、提取次数3次、料液比1:15 (g/mL)。在此条件下，粗多糖最高得率为(14.89±0.18)%，平行验证实验的相对标准偏差为1.21% (n = 3)。随后的抗氧化测定表明，肾蕨总黄酮组分对1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH•)和2,2′-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐自由基阳离子(ABTS•+)均表现出较强的清除能力。在0.1–0.5 mg/mL的测试浓度范围内，粗多糖在四种经典体外抗氧化体系中均表现出显著的浓度依赖性活性增强，包括DPPH自由基清除、ABTS阳离子自由基清除、羟基自由基清除和总还原力。综上，这些发现证实所引入的超声辅助提取策略显著提高了肾蕨中目标生物活性成分的回收效率。总黄酮和粗多糖均表现出优异的体外自由基清除潜力。本研究为这两种生物活性化合物的高效制备提供了坚实的方法学基础，并凸显了肾蕨作为天然抗氧化剂来源的进一步开发潜力。

**肾蕨总黄酮与粗多糖提取工艺优化及体外抗氧化活性研究解读**

**一、研究背景与意义**

肾蕨(Nephrolepis cordifolia (L.) C. Presl)俗称“石黄皮”，属肾蕨科(Nephrolepidaceae)多年生蕨类植物，广泛分布于中国东南各省。在传统民间医药中，其根茎和叶柄长期用于清热、利尿、止咳和解毒，临床上传统上用于治疗发热、肺热咳嗽、睾丸炎、痢疾、肠炎和中耳炎等病症。现代植物化学研究已证实，肾蕨块茎含有黄酮类、多糖类和生物碱类等多种生物活性成分，其中黄酮类化合物是主要的药理活性组分，具有明确的抗肿瘤、抗氧化、保肝和免疫调节活性。然而，以往的研究主要集中在甾醇和三萜类化合物(如β-谷甾醇、齐墩果酸)，对黄酮和多糖的系统性植物化学和药理学研究相对有限，这一知识空白制约了肾蕨作为药用植物资源的综合开发和合理利用。

在提取技术层面，双水相体系(ATPS)是一种由两种不混溶水相组成的高效分离平台，通常由聚合物-聚合物或聚合物-无机盐组合形成，目标化合物依据分配系数差异在两相间选择性分配，可实现温和、高效、一步式提取并同步初步纯化。超声辅助双水相提取(UATPE)协同整合了超声空化效应与ATPS的固有优势——声空化产生的微射流和冲击波破坏植物细胞壁，增强黄酮类化合物的增溶和释放；同时ATPS的温和水相环境最大限度地减少了热敏性生物活性成分的热降解，实现单次操作中的同步提取与初步分离。相比之下，传统乙醇提取虽设备简单、易于工业放大，但需多次提取且效率较低。水提醇沉法仍是回收植物源多糖最广泛采用的方法，而超声辅助提取可显著缩短提取时间并通过声空化和局部高压效应快速破坏植物细胞壁来提高得率。

本研究旨在系统优化肾蕨总黄酮和粗多糖的提取工艺，并评估其体外抗氧化活性，从而为肾蕨生物活性成分的综合开发、天然抗氧化剂的制备及相关功能性食品的研发奠定坚实的科学基础并提供可靠的技术参考。

**二、研究内容概述**

研究人员以肾蕨块茎为原料，分别采用UATPE结合Box-Behnken响应面法和超声辅助水提-醇沉结合L9(3³)正交设计，系统优化了总黄酮和粗多糖的提取工艺。通过单因素实验筛选关键变量，构建响应面模型和正交表确定最优参数组合，并通过体外抗氧化实验全面评价两种活性组分的自由基清除能力和还原力，最终验证了优化工艺的有效性和产物的生物活性价值。

**三、主要技术方法**

本研究使用的肾蕨新鲜块茎购自广东梅州民间康乐百草(批号：MJKLBC202602)，经嘉应学院牟利辉教授依据《中国植物志》(第2-3卷)分类学标准进行形态学鉴定。总黄酮提取采用乙醇-硫酸铵ATPS结合40 kHz、300 W超声辅助，以TFC为响应值，通过Box-Behnken设计构建二次多项式回归模型，利用Design-Expert 13软件优化提取时间、料液比和硫酸铵质量分数。粗多糖提取采用超声辅助水提后乙醇沉淀法，通过L9(3³)正交设计结合极差分析和方差分析(IBM SPSS Statistics 27.0.0)优化提取时间、提取次数和料液比。TFC采用NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH比色法在510 nm处测定(芦丁为参照标准)，多糖含量采用苯酚-硫酸法在490 nm处测定(D-葡萄糖为校准标准)。抗氧化活性通过DPPH自由基清除、ABTS阳离子自由基清除、羟基自由基清除(仅粗多糖)和总还原力(仅粗多糖)四种互补方法综合评价，以抗坏血酸为阳性对照。

**四、研究结果**

**4.1 总黄酮提取工艺优化**

**4.1.1 乙醇-硫酸铵相图构建**：相图清晰划分了双相区(右上方)和单相区(左下方)，双相区中盐富集相(密度较高)形成下层，乙醇富集相(密度较低)构成上层，目标黄酮优先分配至上层乙醇相，而蛋白质和多糖等大分子杂质主要留在下层盐相中。所有后续实验均在双相区内进行以确保稳定的相分离。

**4.1.2 单因素实验结果**：TFC随提取时间延长呈现先升后降趋势，40 min时达最大值；料液比从1:20升至1:40 (g/mL)时TFC先增后降，1:30 (g/mL)时达峰值60.9 mg RE/g DW；硫酸铵质量分数在20%-28%范围内呈钟形依赖关系，24%时最大；乙醇浓度从25%升至35%时黄酮得率逐步增加，35%后趋于平台。

**4.1.3 响应面优化结果**：以提取时间(A)、料液比(B)和硫酸铵质量分数(C)为自变量，通过Box-Behnken设计共进行17次实验，建立二次多项式回归模型Y = 56.45 + 1.16A + 1.65B + 0.1987C + 0.375AB + 0.09AC ? 0.0025BC ? 9.15A² ? 5.94B² ? 6.16C²。方差分析显示模型高度显著(p < 0.0001)，决定系数R² = 0.9971，校正R² = 0.9934，失拟项不显著(p = 0.8500)，变异系数仅1.22%。三因素对TFC影响顺序为：料液比(B) > 提取时间(A) > 硫酸铵质量分数(C)，二次项A²、B²、C²均高度显著(p < 0.0001)，表明各因素与TFC间存在非线性关系。

**4.1.4 最佳黄酮提取条件验证**：经响应面法确定的最佳提取条件为提取时间40.67 min、料液比1:30.71 (g/mL)、硫酸铵质量分数24.03%、乙醇浓度35% (v/v)。三次独立提取的TFC均值为54.83 mg RE/g DW，与预测值56.60 mg RE/g DW接近，绝对偏差1.77 mg RE/g DW，RSD为3.13%。与传统ATPS(49.05 mg RE/g DW)和传统乙醇提取(28.68 mg RE/g DW)相比，UATPE显著提高了提取效率。研究人员同时指出当前仅基于TFC的分析尚不全面，后续将采用液相色谱-串联质谱法鉴定具体黄酮化合物，并测定总酚含量以评估非黄酮酚类对总抗氧化能力的贡献。

**4.2 粗多糖提取工艺优化**

**4.2.1 单因素实验结果**：粗多糖得率随提取时间延长先增后降，15 min时达峰值3.65%；随提取次数增加先增后降，3次时最大(4.91%)；随料液比增加呈现先急剧下降、再略升、再降的趋势，尽管1:10 (g/mL)时表观得率最高(3.11%)，但有限溶剂体积限制了多糖完全溶解。

**4.2.2 正交优化与方差分析**：L9(3³)正交设计极差分析显示三因素影响顺序为：提取次数(B, R = 3.86) > 料液比(C, R = 3.15) > 提取时间(A, R = 1.08)。最佳组合确定为A1B2C2(提取时间10 min、提取3次、料液比1:15 g/mL)。方差分析中三因素F值均低于F0.10(2, 2) = 9.00，表明在实验范围内各因素均未达到0.05显著水平，但极差分析与方差分析结论一致，模型R² = 0.838提供了统计支持。

**4.2.3 最佳粗多糖提取条件验证**：在最佳条件下三次独立提取的粗多糖平均得率为(14.89 ± 0.18)% (RSD = 1.21%)，显著高于单因素实验中的最大得率(4.80%)，且总提取时间(10 min × 3次)远短于传统热水提取(通常1-3 h)，凸显了超声提取的省时节能优势。

**4.3 肾蕨抗氧化活性评估**

**4.3.1 总黄酮抗氧化活性**：三种提取方法所得黄酮提取物的DPPH和ABTS自由基清除能力均随浓度增加呈剂量依赖性增强。在0.18 mg/mL浓度下，两种体系中的清除活性顺序均为抗坏血酸 > UATPE > ATPS > 乙醇提取。UATPE所得黄酮在DPPH和ABTS体系中均表现出最优抗氧化活性，归因于黄酮分子中酚羟基对自由基的有效淬灭以及ATPS温和水相环境对生物活性的良好保护。

**4.3.2 粗多糖抗氧化活性**：在0.1-0.5 mg/mL浓度范围内，粗多糖在四种经典体外抗氧化体系中均表现出显著的浓度依赖性活性增强。0.5 mg/mL时DPPH清除率超过40%，ABTS清除率超过60%，羟基自由基清除率接近30%，总还原力在700 nm处吸光度约0.25，表明其具有中等程度的自由基清除能力和电子供体能力。受限于当前浓度梯度设置，无法通过常规非线性拟合获得具有有效95%置信区间的准确半数抑制浓度(IC₅₀)值。在所有测试浓度点，粗多糖的抗氧化活性均显著低于同浓度抗坏血酸，符合未纯化天然植物粗多糖的活性特征。

**五、讨论与结论**

本研究系统优化了肾蕨总黄酮和粗多糖的提取工艺。总黄酮最佳提取条件为提取时间40.67 min、料液比1:30.71 (g/mL)、硫酸铵质量分数24.03%、乙醇浓度35%，TFC达(54.83 ± 1.58) mg RE/g DW，显著优于传统ATPS和乙醇提取法，证明超声与ATPS的联合可大幅提升提取效率。粗多糖最佳提取条件为提取时间10 min、提取3次、料液比1:15 (g/mL)，得率达(14.89 ± 0.18)% (RSD = 1.21%)，工艺稳定且操作简便。抗氧化活性评估表明，肾蕨总黄酮对DPPH和ABTS自由基均表现出强效的浓度依赖性清除活性，其中UATPE所得黄酮活性最佳；粗多糖在四种体外抗氧化体系中均表现出显著的正浓度依赖性活性增强，确认了其明确的体外抗氧化能力，其机制与供氢效应和还原氧化活性中间体相关。本研究为肾蕨作为生物活性化合物来源的潜在价值提供了初步数据支持。未来研究应聚焦于特定黄酮和多糖的结构鉴定，通过细胞和体内模型验证其生物活性，以及评估安全性、生物利用度和稳定性，这些是功能性食品开发前必不可少的步骤。