口服食物来源原花青素作为免疫刺激剂：通过宿主免疫调节增强小鼠CSFV模型的疫苗免疫原性

《Molecules》：Oral Food-Derived Proanthocyanidins as Immunostimulants: Enhanced Vaccine Immunogenicity via Host Immune Modulation in a Murine CSFV Model

　　

传统注射型疫苗佐剂受限于局部肉芽肿反应、慢性炎症和依从性降低，因此迫切需要安全、宿主导向的策略来增强疫苗免疫原性。原花青素（PACs）——富含于葡萄、可可和茶中的天然多酚——是食物来源的生物活性化合物，具有抗氧化、抗炎和免疫调节活性，使其成为口服免疫刺激剂的有吸引力的候选物。本研究使用经典猪瘟病毒（CSFV）作为模型，该病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），与丙型肝炎病毒和登革热病毒等人类病原体具有保守的基因组和免疫学特征；研究人员在小鼠中系统评估了口服PACs（15、30和60 mg/kg/d）联合减毒活疫苗或亚单位CSFV疫苗的效果。PACs在全剂量范围内均具有良好的耐受性，对体重或主要器官无影响，同时选择性地增加脾脏指数，提示脾靶向免疫激活而无全身性炎症。与单独疫苗相比，中等剂量（30 mg/kg/d）产生最强的免疫刺激作用，尤其是与亚单位疫苗联用时：抗原特异性IgG峰值滴度达到1:409,600，比单独亚单位疫苗（1:102,400）提高4倍，并超过减毒疫苗观察到的3.4倍增益。IgG₂^a和IgG₂^b分别升高199.4%和269.1%，同时Th1（IL-2 +160.6%，IFN-γ +91.9%）和Th2（IL-4、IL-10）细胞因子协同上升，B和T淋巴细胞增殖增强，CD4⁺和CD8⁺亚群扩增，建立了平衡且持久的Th1/Th2应答。这些发现为食物来源的PACs可作为低免疫原性亚单位疫苗的安全口服免疫刺激剂提供了临床前证据，支持其在人类和兽医疫苗学中的进一步开发。

疫苗是预防传染病最有效的手段，但传统注射型佐剂存在局部肉芽肿、慢性炎症和依从性低等安全问题，且不同疫苗类型的免疫原性差异显著。在经典猪瘟病毒（CSFV）疫苗中，减毒活疫苗免疫保护力强但存在毒力返强风险；亚单位疫苗安全性虽高，却因免疫原性较弱而需多次免疫并依赖佐剂。CSFV隶属黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），其基因组与免疫学特征与丙型肝炎病毒、登革热病毒等人类病原体保守，故可作为疫苗免疫调节研究的转化模型。食物来源的原花青素（PACs）是葡萄、可可、茶中丰富的天然多酚，兼具抗氧化、抗炎与免疫调节活性，口服安全且无注射部位不良反应，有望成为新型口服免疫刺激剂。基于此，研究人员利用小鼠CSFV模型，系统评估了口服不同剂量PACs联合减毒或亚单位CSFV疫苗后的免疫应答改变。结果显示，中等剂量（30 mg/kg/d）口服PACs能显著增强疫苗诱导的体液和细胞免疫，尤其对亚单位疫苗效果突出，且不引起体重和器官毒性。该研究为食物来源天然活性成分作为口服免疫佐剂提供了临床前证据，论文发表于《Molecules》。

在方法上，研究人员从河南省实验动物中心获取SPF雌性昆明小鼠（4–6周龄，20–28 g），随机分为空白对照、疫苗对照、疫苗加黄芪多糖（APS）阳性对照及三个PAC剂量组（15、30、60 mg/kg/d），每组11只。口服灌胃给药4天后皮下注射减毒活疫苗或CSFV E2蛋白亚单位疫苗，14天后同剂量加强免疫。样本采集分别覆盖纵向血清学追踪、第35天免疫学检测和第84天生理指标评估。关键技术方法包括：酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗原特异性IgG及IgG1/IgG3/IgG2a/IgG2b亚类和血清细胞因子（IL-4、IL-10、IL-2、IFN-γ）；CCK-8法测定脾脏B、T淋巴细胞增殖；流式细胞术分析外周血CD4⁺、CD8⁺ T细胞亚群；并计算心、肝、肾、脾、胸腺器官指数。统计采用SPSS进行单因素方差分析和重复测量方差分析等。

2.1 PACs对减毒CSFV疫苗免疫小鼠基线生理参数和抗体应答的影响：研究人员通过体重监测和器官指数分析，发现口服PACs各剂量均不影响体重和胸腺、心、肝指数，但低、中剂量显著增加脾脏指数，高剂量呈上升趋势，提示脾脏靶向的免疫激活。动态IgG检测显示，加强免疫后第7天起中、高剂量组抗体上升，第35天达峰，第70–84天仍高于疫苗对照组。IgG亚类分析表明中剂量显著提高IgG1、IgG3和IgG2b，对IgG2a也有提升，支持其增强体液免疫。

2.2 PACs对减毒CSFV疫苗免疫小鼠免疫应答的影响：通过细胞因子ELISA和淋巴细胞增殖及流式分析，发现中剂量PACs显著升高IL-4、IL-10、IL-2和IFN-γ，促进脾B/T淋巴细胞增殖，并提高CD4⁺ T细胞比例；高剂量则显著提高CD8⁺ T细胞比例，提示不同剂量偏向激活不同T细胞亚群。

2.3 PACs对CSFV亚单位疫苗免疫小鼠基线生理参数和抗体应答的影响：安全性观察中，低、中剂量增加脾脏指数，中剂量亦高于APS组，而对胸腺、心、肝无显著影响。IgG动态显示中剂量在维持期（第84天）仍显著高于疫苗对照组和APS组，IgG亚类中中剂量对IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3均有显著或极显著增强，表现出比APS更广更强的抗体提升。

2.4 PACs对CSFV亚单位疫苗免疫小鼠免疫应答的影响：细胞因子检测显示中、高剂量显著升高IL-10、IL-2和IFN-γ，中剂量IL-4最高；所有PAC剂量均促进B细胞增殖，其中低、中剂量显著高于APS组，低剂量和高剂量也显著增强T细胞增殖；流式显示中剂量同时显著增加CD4⁺和CD8⁺ T细胞比例，表明中剂量可激活辅助性和细胞毒性T细胞。

2.5 PACs对不同CSFV疫苗的佐剂效应：通过对比两种疫苗模型，口服PACs使减毒疫苗抗体滴度增强3.4倍，使亚单位疫苗增强4倍（峰值1:409,600 vs 1:102,400），亚单位疫苗中中剂量效果最显著；脾细胞增殖、IgG亚类和细胞因子比较均显示中剂量PACs对IL-2和IFN-γ的促分泌能力最强，且与亚单位疫苗联用时IgG₂^a/IgG₂^b升高幅度更大，而IgG3增强在减毒疫苗中更突出。

讨论部分指出，口服PACs的优势在于安全性好、避免注射局部反应，并通过对脾脏等免疫器官的温和调节将宿主免疫系统调至最佳应答状态；脾脏指数升高伴随淋巴细胞增殖和抗体增强，但无组织病理学证实，不能单独区分免疫激活与病理性增大。亚单位疫苗中相对增强更明显，源于其自身免疫原性低、提升空间大，但具体机制未明确。细胞因子与IgG亚类变化支持混合Th1/Th2应答，但尚不能直接证明抗原特异性Th1/Th2分化。剂量-反应呈非单调的钟形曲线，中剂量对多数指标最优，而高剂量更利于CD8⁺ T细胞应答。研究未与传统佐剂直接比较，且仅使用年轻雌性昆明小鼠，有一定局限性。结论认为，口服食物来源PACs通过系统性调节宿主免疫状态，在不影响生长发育和器官安全性的前提下，显著增强疫苗诱导的体液和细胞免疫，尤其是对弱免疫原性亚单位疫苗可有效补偿其应答不足；中剂量为最佳剂量，PACs兼具安全性、有效性和可食用性，具备作为疫苗联合口服免疫刺激剂的开发潜力。