《Cancers》：Cancer Stem Cells in Colorectal Cancer: From Molecular Mechanisms to Diagnosis, Prognosis and Therapy Implications
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结直肠癌（CRC）仍然是癌症相关死亡的主要原因，复发和治疗耐药性仍是持续存在的挑战。越来越多的证据支持CRC中的癌症干细胞（CSC）模型，其中一群自我更新的结直肠癌干细胞（CCSCs）维持肿瘤生长、转移和治疗耐药性。CCSCs逐渐被认为是肿瘤进展、治疗耐药性和
结直肠癌（CRC）仍然是癌症相关死亡的主要原因，复发和治疗耐药性仍是持续存在的挑战。越来越多的证据支持CRC中的癌症干细胞（CSC）模型，其中一群自我更新的结直肠癌干细胞（CCSCs）维持肿瘤生长、转移和治疗耐药性。CCSCs逐渐被认为是肿瘤进展、治疗耐药性和复发的主要驱动因素，并且不仅作为治疗靶点，还作为CRC中具有诊断和预后意义的生物标志物而受到越来越多的研究。多种信号通路调节CCSC的维持和侵袭行为，包括Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog、PI3K/AKT、MAPK/ERK、NF-κB和TGF-β信号通路。这些通路构成了旨在调节干性相关通路的治疗策略的基础，目前有几种CSC靶向药物和通路抑制剂正在转化研究和临床研究中。与此同时，CCSC表面标志物和分子特征正被探索作为早期检测、微小残留病监测和预后预测的潜在工具。然而，将CSC导向的方法成功转化为有效且安全的临床应用仍然困难。肿瘤异质性、CSC可塑性、代偿性信号机制以及恶性与正常肠道干细胞之间的共享调控网络构成了重大障碍。在本综述中，研究人员总结了CCSC生物学背后的分子机制，讨论了其诊断和预后意义。研究人员还重点关注了在CRC中应用CCSC导向的治疗、生物标志物和预防策略的临床试验。最后，研究人员强调了经验教训和转化挑战，包括需要经过严格验证的CCSC特异性生物标志物，这些挑战继续塑造着这些治疗和生物标志物策略的发展。
2. 结直肠癌中的癌症干细胞概念：癌症干细胞（CSC）假说提出，肿瘤生长由一群具有自我更新、多向分化、肿瘤起始、维持、转移和治疗耐药能力的细胞维持。2.1. CCSC概念的历史演变及其在CRC中的扩展：现代CSC概念起源于急性髓系白血病，其中罕见的CD34+CD38-细胞能在异种移植模型中连续传播疾病。随后在乳腺癌和脑癌等实体瘤中证实了肿瘤起始细胞的存在。在CRC中，2007年两项里程碑式研究首次证明了CSC的存在：研究人员发现CD133阳性细胞亚群（约占肿瘤细胞的2.5%）具有在免疫缺陷小鼠中启动肿瘤生长的能力，并能通过连续移植重现原始肿瘤表型，从而将CRC从随机克隆扩增模型转向包含层次组织和功能异质性的观点。2.2. CCSC的概念模型：层次性与可塑性：经典层次CSC模型认为，肿瘤中存在一个稳定的干细胞区室，少数LGR5+或CD133+的CCSC持续产生分化程度更高的后代，这些后代形成肿瘤主体。相反，基于可塑性的CSC模型强调，干细胞样状态和非干细胞状态是可相互转换的，CCSC特性可在微环境信号、治疗或损伤下获得或丧失。CRC中谱系追踪、类器官和转移研究显示，LGR5-或分化程度更高的细胞能重新获得干细胞样特性，播散的非CSC细胞常形成转移灶，而高效转移生长依赖于在继发部位向CSC状态的转换。这两种模型并非互斥，可能在单个结直肠肿瘤中共存，相对稳定的CCSC层次嵌入更广泛的可塑性系统中，允许非干细胞在选择性压力下重新获得干性。从治疗角度看，仅清除LGR5+或CD133+的CCSC可能削弱层次区室，但为可塑性重建留下途径。2.3. 细胞起源与正常肠道干细胞的关系：正常肠道平衡由位于结肠隐窝底部的LGR5+隐窝基底柱状细胞维持。APC缺失及随之而来的Wnt通路激活在长寿LGR5+干细胞中能高效启动腺瘤和侵袭性CRC，支持干细胞起源模型。然而，积累的证据表明，已分化的祖细胞甚至分化细胞可在致癌或微环境压力下重新获得干性，突出了上皮层次的可塑性，并暗示CCSC可能有多种潜在细胞起源。3. CCSC标志物：CCSC的鉴定和表征依赖于细胞表面标志物和功能测定，以区分肿瘤起始细胞（TIC）与肿瘤主体。过去二十年中，提出了多种CCSC富集标志物，包括CD133、LGR5、CD44、乙醛脱氢酶1（ALDH1）和上皮细胞粘附分子（EpCAM）。研究人员承认CCSC是由功能标准而非单一表面抗原操作定义的。3.1. CD133（Prominin-1）：CD133是一种五跨膜糖蛋白，是首个用于从原发性人结直肠肿瘤中前瞻性分离CCSC的标志物。2007年两项独立研究证明，CD133阳性细胞具有在免疫缺陷小鼠中启动肿瘤生长的独特能力，能自我更新、连续移植并重现肿瘤表型异质性。然而，CD133作为唯一CCSC标志物的可靠性受到质疑，因为其在分化的结肠上皮中广泛表达，且CD133阴性群体也能在异种移植中形成肿瘤。CD133表达与CRC患者较短生存期相关，但因其特异性有限，尚未作为独立临床生物标志物使用。3.2. LGR5：富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（LGR5）于2007年通过谱系追踪实验被鉴定为肠道干细胞标志物。LGR5是Wnt靶基因，其表达依赖于Wnt/β-catenin信号。在CRC中，LGR5表达显著高于正常黏膜，其过表达与侵袭性临床病理特征相关。但LGR5的预后意义存在争议，部分研究显示其过表达与较好结局相关，提示可能反映可塑性CCSC区室中的不同生物学状态。LGR5仍是正常肠道干细胞和CCSC中最具生物学验证价值的标志物之一，但尚未用于常规诊断病理学。3.3. CD44：CD44是一种跨膜糖蛋白，作为透明质酸受体参与细胞粘附、迁移和细胞外基质相互作用。CD44阳性细胞可启动异种移植肿瘤生长，CD44敲低抑制克隆形成和致瘤性，而CD133敲低无类似效果，表明CD44对CCSC活性更重要。CD44v6剪接变体是转移性CCSC的相关标志物，其功能上需要于迁移和转移能力。微环境细胞因子通过Wnt/β-catenin通路上调CD44v6表达，且CD44v6阴性祖细胞可重新获得转移能力。CD44v6过表达与淋巴结转移、远处转移和较差总生存期相关，但研究结果不一致。CD44/CD44v6尚未用于常规诊断，目前主要作为研究标志物、预后生物标志物和潜在治疗靶点。3.4. ALDH1：乙醛脱氢酶1（ALDH1）是一种细胞内酶，参与醛氧化和视黄醇代谢，其活性被用作正常和恶性干细胞的功能标志物。ALDH1阳性细胞富含肿瘤起始能力，能有限稀释生成异种移植肿瘤。ALDH1表达在腺瘤到癌的转变中逐渐增加，其高表达与不良临床病理特征和较差生存期相关。ALDH1可通过ALDEFLUOR测定酶活性或免疫组化检测蛋白，提供互补方法。但不同研究中的底物选择和门控策略差异导致ALDHhigh细胞比例不可比，且正常祖细胞和ALDH表达的非CSC细胞被纳入，限制其特异性。ALDH1尚未用于常规临床，主要作为研究标志物和候选预后生物标志物。3.5. EpCAM和CD166：上皮细胞粘附分子（EpCAM）是一种跨膜糖蛋白，参与细胞-细胞粘附、信号传导和分化。EpCAM通常与其他CCSC标志物联合使用以富集CCSC。Dalerba等人证明，在六例人CRC中，肿瘤起始能力仅限于EpCAMhigh/CD44+亚群，这些细胞能重现父本肿瘤的形态和表型异质性。进一步鉴定出CD166作为EpCAMhigh/CD44+区室内的差异表达标志物，可进一步富集CCSC。EpCAMhigh/CD44+表型与浸润深度、临床分期和转移状态显著相关。尽管EpCAM过表达常与不良临床病理特征相关，但在浸润前沿的膜表达降低与上皮-间充质转化（EMT）和疾病进展相关。EpCAM因在正常上皮组织中广泛表达，尚未作为CCSC特异性临床生物标志物使用，主要用于多参数研究面板和循环肿瘤细胞富集平台。3.6. 组合标志物方法：由于单个标志物在特异性和一致性方面存在局限性，组合标志物策略被开发用于改进CCSC的鉴定和富集。EpCAMhigh/CD44+/CD166+细胞比任何单一标志物更可靠地识别肿瘤起始群体。LGR5+/CD44+/EpCAM+三阳性表型更严格地定义了具有增强自我更新和致瘤能力的CCSC。一项大型组织微阵列队列研究发现，多个标志物表达的丢失，而非任何单一标志物的过表达，与不良临床病理特征和较差生存期相关。因此，CCSC相关标志物应被视为富集假定CCSC的工具，需通过移植、类器官形成和治疗耐药测定进行功能验证，而非假设为唯一定义的干细胞区室。4. CCSC在肿瘤起始、进展和转移中的作用：CCSC被广泛认为是结直肠肿瘤起始、进展和转移扩散的关键驱动因素，为肿瘤内异质性、治疗耐药和疾病复发提供了统一解释。CCSC通过功能测定操作定义，并通过CD133、CD44、EpCAMhigh、LGR5、ALDH1和CD166等标志物富集。功能验证依赖于体内有限稀释异种移植、连续移植、谱系追踪、类器官和球体形成测定以及治疗耐药测定。CCSC富集区室支持长期自我更新、多向分化和连续肿瘤传播。CCSC通过持续增殖和抗凋亡能力促进肿瘤进展和维持，其驱动因素包括Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog、TGF-β/BMP和PI3K/AKT等干性通路的异常激活。CCSC在转移中起关键作用，高干性特征的细胞具有增强的侵袭和迁移能力，促进向肝脏和肺等远处器官播散。转移过程与EMT密切相关，转移起始的CCSC常显示混合的上皮/间充质表型，支持集体迁移和有效转移播种。CCSC还通过分泌细胞因子、趋化因子和细胞外囊泡（EV）参与预转移微环境形成。5. CCSC与肿瘤微环境：CCSC嵌入复杂且动态的肿瘤微环境（TME）中，TME由癌症相关成纤维细胞（CAF）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、T淋巴细胞、内皮细胞等非肿瘤细胞以及细胞外基质（ECM）和可溶性信号分子组成。物理特征如缺氧、酸性pH和营养改变进一步塑造细胞行为。CAF通过旁分泌信号促进CCSC自我更新和干性。Vermeulen等人证明，基质肌成纤维细胞分泌肝细胞生长因子（HGF）增强邻近肿瘤细胞的Wnt信号，恢复克隆形成能力，表明CCSC身份具有可塑性。CAF还通过分泌含有长链非编码RNA H19的细胞外囊泡（EV）激活Wnt/β-catenin信号，赋予奥沙利铂耐药性。TAM常极化为M2样免疫抑制表型，通过分泌白细胞介素-6（IL-6）激活IL-6R/STAT3信号轴，抑制肿瘤抑制因子miR-204-5p，促进癌细胞存活和化疗耐药。缺氧是CRC中TME的标志性特征，通过缺氧诱导因子（HIF）维持CCSC群体。HIF-1α和HIF-2α调节干性标志物表达，HIF-1α与CAF分泌的TGF-β2协同激活GLI2，促进干性和内在化疗耐药。TGF-β驱动的转录程序在基质细胞中激活CAF，重塑ECM，促进肿瘤细胞播散和转移起始。其他TME成分如肿瘤相关中性粒细胞、髓源性抑制细胞和FOXP3+调节性T细胞也参与抑制细胞毒性淋巴细胞活性、促进血管生成和转移，并与增强的癌症干性和不良预后相关。6. CCSC的分子调控：CCSC受信号通路和转录程序的复杂网络调控，这些机制与正常肠道干细胞共享，包括Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog、PI3K/AKT/mTOR和TGF-β/BMP信号。同时，结直肠肿瘤和CCSC经历代谢重编程，包括增强的糖酵解、改变的线粒体氧化代谢和脂质/氨基酸利用。6.1. 信号通路：多条细胞内信号通路调控CCSC的维持、存活和可塑性，包括Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog、TGF-β/BMP、NF-κB和PI3K/AKT/mTOR，这些通路在CRC中常异常激活，驱动肿瘤发生、转移和治疗耐药，并形成高度互联的网络。6.1.1. Wnt/β-catenin：Wnt/β-catenin通路被认为是CCSC维持和肠道干细胞稳态的中心调节因子。在正常组织中，Wnt信号调节隐窝内干细胞更新。在CRC中，APC等关键成分的突变导致β-catenin稳定和核积累，激活TCF/LEF转录因子，调控增殖、存活和干性基因。APC在80%以上的CRC中突变，持续的Wnt/β-catenin活性对肿瘤维持不可或缺。Wnt活性本身功能性标记肿瘤起始区室，高Wnt活性细胞富集CCSC标志物，显示增强的克隆形成和致瘤能力，且微环境信号可重编程Wnt依赖性CCSC状态。Wnt靶基因如MYC、AXIN2、LGR5和抗凋亡介质在Wnt活性CCSC中上调。实验性Wnt/β-catenin抑制导致已建立肿瘤生长受损、分化增加和肿瘤起始能力降低，反映CCSC池的耗竭。6.1.2. Notch：Notch信号在肠道细胞命运决定和干细胞维持中起重要作用。在正常肠上皮中，Notch维持祖细胞群体并抑制分化。在CRC中，失调的Notch信号促进肿瘤进展、转移和CSC群体维持。Notch活性在结肠癌起始细胞中显著升高，对其自我更新和抑制分泌分化是必需的。ALDH1A1通过激活Notch通路增强CRC转移，而表观遗传调控通过去甲基化miR-184抑制Notch信号从而抑制转移。Notch信号还调控早期转移事件中脱离细胞簇的生长和存活。Notch与Wnt信号之间存在大量串扰，共同维持CCSC的未分化、自我更新状态。6.1.3. Hedgehog：Hedgehog（Hh）信号是发育通路，参与干细胞调节和肿瘤进展。在CRC中，Hh信号主要通过旁分泌激活基质细胞，补充CAF和TAM介导的通路。肿瘤来源的Sonic Hh激活基质细胞中的Hh信号，药理学Hh阻断重塑基质并改变肿瘤生长。基质Hh信号在CRC中下调，恢复该信号抑制肿瘤生长并减少干细胞样肿瘤特征。Hh信号也被证明直接维持干细胞样区室，非经典Hh活性正调控Wnt信号，对CCSC存活是必需的，可促进CCSC扩增和化疗耐药。Hh信号还影响肿瘤免疫微环境，改变细胞因子谱和免疫细胞浸润模式。6.1.4. PI3K/AKT：PI3K/AKT通路是细胞存活、代谢和增殖的中枢调节因子。在CRC中，PIK3CA突变或上游受体酪氨酸激酶激活导致异常激活。PI3K/AKT/mTOR抑制在CRC干细胞富集培养中减少球体形成、诱导凋亡并降低干性标志物表达。该通路在转录后水平受microRNA（miRNA）和非编码RNA严格调控，多个miRNA调节PI3K/AKT通路成分，影响CCSC标志物如CD44v6的表达。PI3K/AKT与Wnt/β-catenin、Hippo、MAPK/ERK和TGF-β等通路广泛串扰，维持增殖和干细胞样信号，即使单个通路被药理学抑制。PI3K驱动的HER2/CD44v6表达被鉴定为维持CCSC的关键轴。6.1.5. MAPK/ERK：MAPK/ERK通路是细胞增殖和分化的主要调节因子。KRAS和BRAF等癌基因突变导致组成性激活，促进CRC细胞增殖和肿瘤进展。高MAPK活性定义CRC内侵袭性亚群，ERK抑制减少克隆形成和致瘤能力。MAPK/ERK激活增强CRC细胞侵袭和迁移能力，如PBX3通过激活MAPK/ERK促进细胞迁移和侵袭。NSUN2驱动的ERK信号激活促进LGR5+肠道干细胞扩增和APC驱动的肿瘤发生。MAPK/ERK与PI3K/AKT和Wnt信号相互作用，通过冗余途径维持CCSC存活和治疗耐药。6.1.6. NF-κB：NF-κB信号通路将炎症与结直肠肿瘤发生和CSC维持联系起来。在CSC富集模型中，NF-κB活性支持自我更新、克隆形成和治疗耐药，药理学或遗传学抑制降低CSC频率和致瘤能力。炎症介质前列腺素E2通过EP4-PI3K和EP4-MAPK信号激活NF-κB，驱动CCSC扩增和肝转移。间充质干细胞等基质成分通过细胞因子和AMPK/mTOR依赖性信号激活CRC细胞中NF-κB，增强球体形成和EMT。NF-κB激活诱导抗凋亡基因如Bcl-2家族成员转录，使肿瘤细胞逃避死亡。放疗诱导的NF-κB激活与直肠癌患者较差总生存期和增加远处转移相关，RAC1下游ROS依赖性NF-κB激活促进WNT驱动的肠道干细胞增殖和CRC起始。6.1.7. TGF-β：转化生长因子-β（TGF-β）通路在CRC中发挥双重作用，早期作为肿瘤抑制因子，晚期促进肿瘤进展、侵袭和转移。TGF-β信号通过Smad转录因子调控细胞周期停滞、分化和凋亡。在进展期CRC中，TGF-β信号通过旁分泌作用于基质细胞启动转移，增强肿瘤侵袭和播散。TGF-β信号通过促进细胞可塑性和使肿瘤细胞获得干细胞样表型来维持CSC特性。例如，TGF-β通过TWIST1诱导将CD44阴性非CSC转化为CD44阳性CSC，增加CSC池。ALG10/TGF-β正反馈环通过TGFBR2糖基化维持通路活性，对CRC干性至关重要。TGF-β诱导的EMT和上皮-间充质可塑性赋予癌细胞CSC样特征。6.1.8. JAK/STAT3：JAK/STAT3信号轴是CRC中炎症和细胞因子驱动反应的中枢介质，已成为CCSC维持、肿瘤-微环境相互作用和治疗耐药的关键调节因子。IL-6驱动的STAT3激活促进CCSC表型，增加球体形成、干性标志物表达和对氟尿嘧啶及奥沙利铂的耐药性。TAM和CAF分泌IL-6等细胞因子，创建旁分泌环，使肿瘤细胞STAT3驱动CCSC维持和免疫逃逸。JAK/STAT3还参与EMT、血管生成和转移扩散。STAT3靶基因包括抗凋亡和促存活通路调节因子。药理学JAK或STAT3抑制减少球体形成、下调干性相关转录本（如NANOG和SOX2），并恢复对化疗和放疗的敏感性。6.1.9. CCSC中的信号串扰：调控CCSC生物学的关键信号通路表现出广泛的分子串扰，协调干性、细胞可塑性、存活、增殖、EMT和炎症反应。Notch释放的NICD结合并隔离GSK-3β，PI3K/AKT通路高活化的AKT磷酸化并失活GSK-3β，两者均阻止β-catenin降解，使其独立于Wnt配体积累。非经典Hh信号维持Wnt/β-catenin活性。MAPK/ERK和PI3K/AKT通路通过互补翻译后机制稳定Snail1，TGF-β激活的Smad3/4形成转录抑制复合物抑制E-cadherin表达，驱动EMT。微环境细胞因子激活NF-κB，驱动IL-6分泌，触发JAK/STAT3通路，STAT3上调LIN28，抑制let-7 miRNA，形成持续炎症和干性自维持环。TGF-β/Smad3直接结合GLI2启动子，确保即使SMO抑制剂治疗时Gli介导的存活基因仍活跃。STAT3、NF-κB、Smad和Gli蛋白在NANOG、SOX2和OCT4等全能性基因启动子上的汇聚，创建冗余存活基质，确保通路被阻断时替代输入补偿。6.2. 表观遗传调控和转录控制：CCSC行为还受表观遗传机制和转录程序调控，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑。CCSC富集球体和异种移植物表达更高水平的DNMT1，显示更广泛的启动子高甲基化，DNMT1抑制减少CSC丰度并阻止肝转移生长。干性转录因子如SOX2、OCT4、NANOG和MYC受表观遗传调节因子调控。EZH2介导的H3K27三甲基化通过抑制p21CIP1驱动CRC干细胞样细胞扩增，激活Wnt/β-catenin信号。PI3K/A
