NF-κB/Lipocalin 2信号通路通过促进铁死亡减轻BRAFV600E突变结直肠癌对顺铂的化疗耐药性

《Cancers》：NF-κB/Lipocalin 2 Signaling Pathway Mitigates the Chemoresistance of BRAFV600E-Mutant Colorectal Cancer to Cisplatin by Promoting Ferroptosis

　　

背景：携带BRAFV600E突变的结直肠癌（CRC）具有侵袭性临床行为及化疗耐药性，其潜在机制尚未明确。铁死亡作为一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡形式，已成为潜在的治疗靶点。本研究旨在探讨NF-κB/Lipocalin 2（LCN2）通路是否通过芬顿反应（Fenton reaction）诱导的铁死亡调控BRAFV600E过表达CRC细胞对顺铂的敏感性。方法：研究人员通过免疫组织化学检测临床CRC标本中BRAF突变状态及LCN2、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、 cleaved caspase3的表达，利用癌症基因组图谱（TCGA）数据集评估铁死亡与凋亡标志物及5年生存率的相关性。构建LCN2敲低/敲除或BRAF/BRAFV600E/LCN2过表达的CRC细胞系，评估顺铂处理下的细胞增殖、脂质代谢、铁水平及NF-κB/LCN2信号通路变化。采用BALB/c裸鼠异种移植模型进行体内验证。结果：BRAFV600E突变临床标本中，铁死亡标志物PTGS2及铁代谢调节因子LCN2表达显著降低。在KRAS突变细胞模型中，BRAFV600E过表达通过抑制NF-κB/LCN2信号轴，削弱顺铂诱导的铁死亡，导致芬顿反应介导的脂质过氧化受损。恢复LCN2表达可在体外及体内重新增强BRAFV600E过表达细胞对顺铂的敏感性。值得注意的是，凋亡抑制参与了BRAFV600E过表达细胞对顺铂诱导铁死亡的抵抗，提示铁死亡与凋亡在治疗耐药中存在交互作用。结论：研究结果表明，在KRAS突变背景下，NF-κB/LCN2轴通过驱动芬顿反应诱导的铁死亡，增强BRAFV600E过表达CRC细胞对顺铂的敏感性。LCN2恢复可在体外及体内部分克服BRAFV600E过表达介导的耐药性，提示LCN2是潜在的治疗靶点。铁死亡与凋亡的交互作用为克服这一高危CRC亚型的化疗耐药提供了潜在策略。

本研究发表于《Cancers》，聚焦BRAF^V600E突变结直肠癌这一临床难治亚型。该亚型占CRC的8%–10%，具有微卫星不稳定、分化差、淋巴结转移率高及预后极差的特征，即便接受新辅助化疗，患者无病生存期与总生存期仍显著缩短。目前其化疗耐药机制尚未明确，而铁死亡作为铁依赖性脂质过氧化驱动的新型调节性细胞死亡形式，在克服实体瘤耐药中展现潜力，但BRAF^V600E突变对铁死亡的调控作用仍待阐明。Lipocalin 2（LCN2）作为铁稳态与炎症应答的关键调控蛋白，其表达受NF-κB转录调控，且在CRC转移抑制、化疗增敏中发挥作用，但其在BRAF^V600E突变CRC铁死亡中的角色存在争议。基于此，研究人员旨在明确NF-κB/LCN2信号通路是否通过铁稳态失调调控BRAF^V600E突变CRC的顺铂耐药性，为克服该亚型耐药提供新靶点。

研究人员采用的关键技术方法包括：收集80例经荧光PCR验证BRAF突变状态的临床CRC标本（61例BRAF野生型，19例BRAF^V600E突变）进行免疫组织化学分析；基于TCGA COAD数据集开展基因表达相关性及生存分析；构建BRAF/BRAF^V600E过表达、LCN2敲低/敲除及LCN2过表达的CRC细胞系；通过细胞增殖检测、亚铁离子（Fe²⁺）水平检测、活性氧（ROS）检测及线粒体膜电位检测评估铁死亡表型；建立BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型验证体内药效；采用广谱 caspase 抑制剂ZVAD-FMK干预探究铁死亡与凋亡的交互作用。

3.1 BRAF与V600E突变和CRC中铁死亡标志物的相关性

研究人员分析TCGA数据发现，BRAF在CRC肿瘤组织中表达显著高于正常组织，且与促铁死亡标志物酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）、PTGS2呈正相关，与抗铁死亡分子谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、铁蛋白重链1（FTH1）呈负相关。临床标本检测显示，BRAF^V600E突变肿瘤中LCN2与PTGS2阳性率显著低于野生型组织，提示BRAF^V600E突变可能通过调控这些蛋白参与铁死亡。

3.2 BRAF与LCN2相关且V600E/NF-κB/LCN2信号通路参与顺铂诱导的铁死亡

在HT29细胞中，BRAF敲低导致LCN2与PTGS2表达下降；LCN2敲低或敲除则显著下调BRAF表达，而LCN2过表达可上调BRAF水平，证实二者存在正相关。在DLD1细胞中，BRAF过表达及顺铂处理均可上调ACSL4、LCN2及磷酸化p65水平，而BRAF^V600E过表达可削弱顺铂的这一效应，提示BRAF^V600E可能通过抑制NF-κB/LCN2信号通路负调控顺铂诱导的铁死亡。

3.3 BRAF^V600E过表达通过抑制NF-κB/LCN2信号通路削弱顺铂诱导的铁死亡

研究人员发现，BRAF过表达与顺铂处理诱导的细胞内ROS水平升高可被BRAF^V600E过表达下调；BRAF^V600E过表达还可减轻BRAF过表达导致的细胞内Fe²⁺积累。细胞增殖实验显示，BRAF^V600E过表达对顺铂的保护效应随时间减弱。TCGA分析显示，铁外排蛋白 ferroportin（FPN，由SLC40A1编码）低表达与CRC患者较差的5年生存率相关，但肿瘤组织中BRAF与FPN表达无显著相关性，且BRAF^V600E过表达仅轻微上调FPN，不影响顺铂的作用，提示BRAF^V600E可能通过NF-κB/LCN2轴而非FPN调控铁稳态介导顺铂耐药。

3.4 LCN2通过BRAF^V600E/NF-κB通路减轻顺铂耐药

TCGA分析显示NF-κB p65（RELA）在CRC肿瘤组织中高表达，但与5年生存率及BRAF水平无显著相关性。在BRAF^V600E过表达细胞中，顺铂处理48小时后磷酸化p65与LCN2水平显著降低。恢复LCN2表达后，顺铂对细胞活力的抑制作用显著增强，同时细胞内ROS、Fe²⁺水平升高，线粒体膜电位下降。临床标本免疫组化分析显示，LCN2阳性组织中PTGS2阳性率显著高于LCN2阴性组织，且二者表达呈正相关，证实LCN2通过促进BRAF^V600E/NF-κB调控的铁死亡增强CRC细胞对顺铂的敏感性。

3.5 BRAF^V600E过表达显著促进体内肿瘤生长，而LCN2恢复可克服BRAF^V600E异种移植模型的顺铂耐药

体内实验显示，无论是否接受顺铂治疗，BRAF^V600E过表达肿瘤体积均显著大于野生型BRAF过表达肿瘤，证实其促顺铂耐药作用。而共过表达LCN2与BRAF^V600E的肿瘤在顺铂处理后生长显著受抑，提示LCN2是BRAF^V600E介导顺铂耐药的关键效应分子。

3.6 凋亡信号参与LCN2调控的BRAF^V600E过表达细胞顺铂诱导的铁死亡

研究人员发现顺铂处理可降低线粒体膜电位，而BRAF^V600E过表达可逆转该效应，提示凋亡可能参与调控。使用广谱 caspase 抑制剂ZVAD-FMK抑制凋亡后，BRAF/BRAF^V600E过表达细胞对顺铂的存活能力增强，顺铂与BRAF过表达诱导的ROS升高被显著抑制。LCN2过表达可增强BRAF^V600E过表达细胞对顺铂的敏感性，且该效应不受ZVAD-FMK影响。TCGA分析显示，凋亡标志物caspase3在肿瘤组织中低表达且与较差的5年生存率相关，且与促铁死亡标志物ACSL4、PTGS2、转铁蛋白受体（TFRC）呈正相关，与抗铁死亡分子FTH1、GPX4呈负相关。临床标本免疫组化结果也显示cleaved caspase3与PTGS2表达呈正相关，提示凋亡抑制可能通过抑制铁死亡参与BRAF^V600E过表达介导的顺铂耐药。

讨论部分指出，BRAF^V600E突变转移性CRC预后极差，现有联合治疗方案仍未完全解决耐药问题。本研究首次在KRAS突变背景下证实，NF-κB/LCN2信号轴失调通过铁稳态失衡抑制铁死亡，导致BRAF^V600E过表达CRC顺铂耐药，且LCN2恢复可部分逆转该表型。研究澄清了LCN2在CRC铁死亡中的功能争议，其生物学效应具有高度背景依赖性，本研究结果仅适用于BRAF^V600E过表达这一特定遗传背景。此外，研究揭示了铁死亡与凋亡在顺铂耐药中的交互作用，为联合靶向两种细胞死亡通路克服耐药提供了依据。研究同时指出局限性：聚焦LCN2对铁稳态的调控，未全面解析铁死亡信号网络；所用DLD1细胞系携带内源性KRAS突变，需在无KRAS突变细胞系中验证；临床标本样本量有限，需扩大队列并联合多铁死亡标志物验证。总体而言，本研究为BRAF^V600E突变CRC的靶向治疗提供了新思路，LCN2有望成为该亚型的治疗靶点。

结论部分翻译：综上，本研究表明，在KRAS突变CRC背景下，BRAF^V600E过表达伴随NF-κB/LCN2信号通路失调，可导致铁稳态受损及铁死亡减弱，进而在BRAF^V600E过表达同源模型中介导顺铂耐药。值得注意的是，顺铂可同时激活铁死亡与凋亡，凋亡抑制可减弱顺铂对BRAF^V600E过表达CRC细胞的细胞毒性，而恢复LCN2表达可减轻顺铂耐药。尽管需在KRAS野生型背景下进一步验证以明确BRAF^V600E的特异性效应及铁死亡与凋亡的交互机制，本研究仍为联合诱导铁死亡与凋亡以克服治疗耐药提供了新视角，提示LCN2是CRC治疗耐药中具有潜力的生物标志物与治疗靶点。