全基因组鉴定Ca2+-ATP酶基因家族及MdACA39在苹果中抗链格孢菌的功能分析

《Plants》：Genome-Wide Identification of the Ca2+-ATPase Gene Family and Functional Analysis of MdACA39 in Resistance to Alternaria alternata in Malus domestica

　　

钙离子转运ATP酶（Ca²⁺-ATPase，即钙离子转运ATP酶）基因家族维持植物细胞内Ca²⁺稳态，并调控生长、发育和胁迫免疫；然而，其在苹果（Malus domestica）中的功能尚未得到充分表征。研究人员对苹果Ca²⁺-ATPase基因进行了全基因组鉴定，获得了45个成员，这些成员被分为MdACA（39个）和MdECA（6个）亚家族，不均匀地分布在14条染色体上。对苹果、拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）的Ca²⁺-ATPase基因进行系统发育分析，将这些蛋白质分为五个亚组。ACA和ECA亚家族在不同物种间高度保守，而D组是苹果特异性的。共线性和Ka/Ks分析表明，片段重复和纯化选择主导了苹果Ca²⁺-ATPase基因的进化。启动子顺式元件预测发现了许多与植物激素信号、生长、发育和胁迫防御相关的调控元件。密码子使用偏好分析表明，AUG（甲硫氨酸）是优势密码子。组织表达谱显示苹果Ca²⁺-ATPase基因在不同器官中存在差异表达。定量实时PCR（qRT-PCR）检测表明，Ca²⁺-ATPase基因对链格孢菌（Alternaria alternata）感染、外源CaCl₂、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）有广泛响应，其中MdACA39在所有处理下均被强烈诱导。亚细胞定位证实MdACA39位于质膜上。此外，MdACA39的瞬时过表达显著增强了苹果对A. alternata的抗性，这可能是由于激活了SA、MeJA和Ca²⁺信号介导的免疫途径，诱导了抗病相关基因，并提高了抗氧化酶活性。总之，本研究系统地表征了苹果Ca²⁺-ATPase家族，并确定MdACA39是真菌抗性的关键调控因子，为解析Ca²⁺信号介导的苹果抗病性提供了有价值的基因资源。

苹果是全球广泛栽培的重要落叶果树，但生产中常遭受生物胁迫，其中由链格孢菌（Alternaria alternata f. sp. mali）引起的苹果斑点落叶病严重危害产量和果实品质，制约产业可持续发展。钙离子（Ca²⁺）作为植物细胞中关键的胞内第二信使，广泛参与生长、发育及胁迫响应，尤其在病原菌入侵时激活免疫调控通路。钙离子转运ATP酶（Ca²⁺-ATPase）通过将胞浆Ca²⁺泵出细胞或泵入细胞器，精确调控胞内Ca²⁺稳态和信号模式，在植物免疫中发挥核心作用。然而，苹果中Ca²⁺-ATPase基因家族的系统鉴定和抗病功能研究尚属空白，特别是缺乏将进化分析、表达谱与体内功能验证相结合的研究。因此，开展全基因组鉴定并解析关键成员MdACA39在抗链格孢菌中的功能，对揭示Ca²⁺信号介导的苹果抗病机制及分子育种具有重要意义。该论文发表在《Plants》。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：①基于隐马尔可夫模型（HMM）和保守域验证进行全基因组鉴定；②利用MEGA 11.0构建邻接法系统发育树及共线性分析（MCScanX）；③通过PlantCARE数据库预测启动子顺式作用元件；④采用CodonW v1.4.2分析密码子使用偏好；⑤借助NCBI GEO数据库（GSE42873）进行组织表达谱分析；⑥通过qRT-PCR检测多胁迫下基因表达；⑦利用农杆菌介导的烟草（Nicotiana benthamiana）瞬时转化进行亚细胞定位；⑧采用农杆菌介导的真空渗透法对苹果‘Gala-3’品种离体叶片进行瞬时过表达和RNA干扰（RNAi）功能验证，病原菌A. alternata分离自中国甘肃苹果园。

**2.1 苹果Ca²⁺-ATPase基因家族的鉴定与理化性质分析**：通过全基因组鉴定获得45个家族成员，分为MdACA（39个）和MdECA（6个）两个亚家族，不均匀分布在14条染色体上；理化性质显示氨基酸长度485–2062 aa，多数为酸性稳定疏水蛋白。

**2.2 苹果Ca²⁺-ATPase蛋白的亚细胞定位预测与二级结构分析**：预测主要定位于质膜、内质网和液泡；二级结构以α-螺旋（40.09–50.79%）和无规卷曲（27.77–33.00%）为主。

**2.3 苹果与代表性植物物种Ca²⁺-ATPase基因家族的系统发育分析**：系统发育树将苹果、拟南芥和水稻的Ca²⁺-ATPase分为五个亚组（A–E），其中A、B、C、D组对应ACA亚家族，E组对应ECA亚家族；D组为苹果特有，表明该家族在进化中既保守又发生物种特异性扩张。

**2.4 苹果Ca²⁺-ATPase基因家族共线性与基因重复分析**：种间共线性分析显示苹果与双子叶植物（拟南芥、葡萄）的同源基因对（45和44对）多于单子叶植物（水稻26对、玉米20对）；种内共线性鉴定出25对重复基因对，均为片段重复，且Ka/Ks比值均<1，表明受纯化选择。

**2.5 苹果Ca²⁺-ATPase基因的保守基序、启动子顺式作用元件与基因结构分析**：所有成员均包含基序1、2、10，且除MdACA06外均含基序4；启动子富含光、激素（MeJA、ABA、SA等）和胁迫响应元件；基因结构中外显子数1–67不等，部分基因缺乏非翻译区（UTR）。

**2.6 苹果Ca²⁺-ATPase基因家族密码子使用偏好分析**：偏好以G和U结尾的密码子，共26个偏好密码子，其中AUG（甲硫氨酸）的RSCU值为3.0，使用偏好最强；相关分析显示密码子使用受碱基组成等因素影响。

**2.7 苹果Ca²⁺-ATPase基因家族蛋白互作网络与组织特异性表达**：蛋白互作网络预测MdECA06为核心枢纽蛋白；组织表达谱显示30个基因有组织偏好，如MdACA09和MdACA25在所有组织中高表达，MdACA13和MdACA16在花器官中特异高表达。

**2.8 多胁迫处理下Ca²⁺-ATPase基因家族的qRT-PCR表达分析**：13个代表基因在A. alternata、CaCl₂、SA和MeJA处理下呈现差异表达，其中MdACA39在所有处理中均被强烈诱导，例如在MeJA处理3 h时表达量上升94.9倍，表明其为核心应激响应基因。

**2.9 MdACA39的亚细胞定位**：通过构建35S-MdACA39-GFP融合载体在烟草叶片中瞬时表达，共聚焦显微镜显示MdACA39-GFP荧光与质膜标记物共定位，证实其定位于质膜。

**2.10 瞬时过表达MdACA39增强苹果对A. alternata的抗性**：在‘Gala-3’苹果叶片中进行瞬时过表达和RNAi，表型鉴定显示MdACA39过表达显著减少病斑面积和病情指数，病原菌生物量（Alta1基因表达）降低，而RNAi加重感病；钙离子含量在过表达叶片中降低，RNAi叶片中升高，表明MdACA39参与钙稳态调控。

**2.11 MdACA39介导的抗病相关基因表达分析**：qRT-PCR检测显示，过表达MdACA39显著上调SA通路基因（MdPR1、MdPR2）、JA通路基因（MdMYC2、MdPR4）、钙信号组分（MdCML、MdCDPK4）和转录因子MdWRKY33的表达，RNAi则抑制这些基因表达，表明MdACA39正调控多条抗病信号通路。

**2.12 MdACA39转化苹果叶片的抗氧化系统分析**：过表达MdACA39上调抗氧化酶基因（MdSOD、MdCAT、MdGPX、MdAPX）表达，降低超氧阴离子（O₂^?）和过氧化氢（H₂O₂）积累；RNAi则抑制抗氧化酶基因并导致ROS过度积累，表明MdACA39通过激活抗氧化系统清除ROS来增强抗病性。

**3. 讨论**：研究人员讨论了苹果Ca²⁺-ATPase家族的进化保守性与结构多样性，指出片段重复和纯化选择主导了家族扩张，保守基序确保钙转运功能，而外显子及UTR变异提供了功能分化基础。启动子顺式元件富集表明该家族整合多种信号调控生长和胁迫适应。MdACA39作为质膜定位的Ca²⁺泵，通过塑造Ca²⁺信号、激活SA/JA通路和抗氧化系统正向调控抗病性，与拟南芥中质膜定位的AtACA8/AtACA10功能一致，而与液泡或内质网定位的负调控成员不同，提示亚细胞定位决定免疫功能。同时指出瞬时表达系统局限性，未来需采用稳定遗传转化和基因敲除深入研究。

**5. 结论**：本研究对苹果（Malus domestica）Ca²⁺-ATPase基因家族进行了系统鉴定和生物信息学分析，共鉴定出45个家族成员，分为MdACA和MdECA两个亚家族，不均匀分布在14条苹果染色体上，其中1个基因位于未锚定支架（Chr00）。系统发育分析将这些基因分为五个保守亚组，其中D组为苹果特异性。片段重复主导了基因家族扩张，且基因经历了强纯化选择。表达筛选显示MdACA39受A. alternata感染、Ca²⁺、SA和MeJA处理显著诱导。亚细胞定位证实MdACA39位于质膜。瞬时表达实验进一步验证了MdACA39通过触发防御基因表达、增强抗氧化能力和维持钙稳态，正向增强苹果对A. alternata的抗性。研究结果阐明了苹果Ca²⁺-ATPase的进化特征，揭示了MdACA39的正向抗病功能，为培育抗真菌苹果品种提供了理论支持和基因资源。