磁性纳米颗粒辅助固定化酿酒酵母与马克思克鲁维酵母共培养：对乙醇生产、糖消耗、生物量复用及挥发性代谢物谱的影响

《Journal of Fungi》：Magnetic Nanoparticle-Assisted Immobilized Co-Culture of Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus: Effects on Ethanol Production, Sugar Consumption, Biomass Reuse, and Volatile Metabolite Profiles

　　

酵母辅助的混合培养发酵因其能提升发酵效率并调控代谢物生成而备受关注，关于磁性纳米颗粒辅助固定化对酒精发酵中酵母-酵母互作的影响尚知之甚少。本研究将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）与马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）共培养体系固定于壳聚糖包覆的四氧化三锰（MnFe2O4）纳米颗粒上，应用于甘蔗废蜜（sugarcane molasses）与甘蔗汁的发酵。壳聚糖包覆MnFe2O4纳米颗粒通过一步共沉淀反应结合水热处理制备，并经X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、振动样品磁强计（VSM）及扫描电子显微镜（SEM）表征。研究表明，固定化共培养体系较非固定化细胞发酵具有更快的糖消耗速率与更高的乙醇产量。重复发酵周期证实了固定化生物量的操作稳定性及复用带来的乙醇增产。单培养、共培养、非固定化与固定化体系间挥发性代谢物的生物合成存在差异，酵母互作与磁性固定化亦影响发酵次生代谢物生成。上述发现确认磁性纳米颗粒辅助共培养发酵可作为一种极具吸引力的纳米生物技术工具以增强酒精发酵，并为固定化条件下酵母与纳米结构体系的互作提供新见解。

研究背景方面，酵母酒精发酵是生产饮料、生物燃料及高值化合物的关键生物工艺，混合培养因能优化底物利用、胁迫耐受与代谢物生成而受关注。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）工业乙醇能力强但非酿酒酵母如马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）具耐热、底物广、产香特性，共培养可产生协同代谢响应。细胞固定化能提供生物量回收简便、操作稳定、抗抑制物与可复用等优势，磁性纳米颗粒因比表面大、易磁分离成为理想载体，其中壳聚糖包覆四氧化三锰（MnFe₂O₄）兼具磁性与生物相容性。然而磁性纳米复合辅助固定化对混合酵母互作及代谢物谱的影响此前未知，既有研究多聚焦单菌固定化，故本研究在甘蔗废蜜与甘蔗汁底物中评估壳聚糖包覆MnFe₂O₄固定化两菌共培养对乙醇、糖耗、生物量复用及挥发性代谢物的影响，论文发表于《Journal of Fungi》。

关键技术方法上，研究人员从墨西哥科阿韦拉自治大学食品研究部菌种保藏中心获取S. cerevisiae与K. marxianus，以YPG培养基制备接种物；底物为墨西哥塔毛利帕斯糖业提供的甘蔗废蜜与甘蔗汁，稀释至20 °Brix并补加磷酸盐、铵盐与镁盐。壳聚糖包覆MnFe₂O₄纳米颗粒由Fe/Mn摩尔比2:1共沉淀结合水热法合成。酵母与纳米颗粒（460 mg/mL）室温吸附30分钟实现固定化，外磁场分离。发酵于500 mL三角瓶300 mL培养基32 °C、150 rpm厌氧条件进行42 h；复用周期以磁回收洗涤后转接新鲜废蜜培养基。糖与乙醇经高效液相色谱（HPLC，Aminex HPX-87P柱）定量，挥发性化合物经实验室蒸馏后气相色谱（GC-FID，CP-WAX 10柱）分析，纳米材料经XRD、VSM、FTIR与SEM表征，数据三重平行以ANOVA（p<0.01）检验。

研究结果部分，3.1节壳聚糖包覆MnFe₂O₄纳米颗粒表征显示XRD证实立方尖晶石结构，壳聚糖包覆后晶粒尺寸由15.2 nm降至11.1 nm；VSM显示室温铁磁性，饱和磁化强度12.78 emu/g、矫顽力814.75 Oe、剩磁3.87 emu/g，满足磁分离需求；FTIR确认壳聚糖O-H、N-H、C-N、C-O官能团成功接枝。3.2节SEM显示两菌卵形形态保留，纳米颗粒簇集附着胞壁无形态损伤，磁回收高效。3.3节糖耗与乙醇动力学表明，废蜜与甘蔗汁中固定化共培养残糖更低、乙醇更高，废蜜中固定化共培养42 h近完全糖耗，峰值乙醇优于非固定化共培养。3.4节生物量复用显示前5周乙醇稳于60–63 g/L，第6周期降至54 g/L仍保高活性。3.5节挥发性物分析中，K. marxianus单培乙醇最低（29.1 g/L）但乙酸乙酯（3.54 g/100 L）与高级醇（145.0 g/100 L）最高；S. cerevisiae 150单培乙醇50.7 g/L；非固定化共培养乙醇63.1 g/L、乙醛15.37 g/100 L、高级醇180.0 g/100 L；固定化共培养最优，乙醇70.0 g/L、乙酸乙酯4.77 g/100 L、高级醇185.4 g/100 L且乙醛降低。

讨论部分指出，壳聚糖氨基/羟基与Fe³⁺、Mn²⁺配位抑制晶粒生长，其正电荷与酵母胞壁负电荷（磷酸甘露聚糖/羧基）静电结合并由氢键稳固，磁核被非磁壳层包覆致Ms下降但不碍分离。固定化微环境提升局部细胞密度、屏蔽乙醇毒性与渗透压，共培养中K. marxianus速生供前体、S. cerevisiae高产耐醇形成交叉喂养，磁性固定化进一步拉近细胞距离强化代谢偶联，故糖耗加速、乙醇与产香并行。复用衰减源于长期磁分离与搅拌致部分细胞脱落及毒性累积，但仍优于游离体系。挥发性谱变化反映固定化改质传递与氧化还原稳态，产物均低于墨西哥PROY-NOM-199-SCFI-2015限值，具备朗姆酒类甘蔗蒸馏物调香潜力。

结论部分翻译如下：综上，本研究证明壳聚糖包覆四氧化三锰（MnFe₂O₄）纳米颗粒构成一种高效纳米结构平台，可用于甘蔗衍生底物酒精发酵中酿酒酵母与马克思克鲁维酵母的共固定化。相较于非固定化细胞体系，磁性共固定化策略提升了发酵表现，体现为增强的糖利用、更高乙醇生产率，以及发酵周期中固定化生物催化系统的成功回收与重复复用。此外，固定化共培养呈现挥发性代谢物谱的改变，表明固定化与酵母-酵母互作共同影响了发酵来源代谢物。整体结果支持壳聚糖包覆MnFe₂O₄纳米颗粒作为可复用纳米生物催化载体用于开发更高效发酵工艺的潜力。需进一步研究（含直接细胞活性测定、生物量滞留与代谢活性分析）以明晰固定化细胞长期复用中的生理行为。