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Insidiosum疫霉（Pythium insidiosum）作为腐皮病的致病因子，仍是热带和亚热带地区的重要病原体，在这些地区，诊断延迟往往与重症及不良临床结局相关。研究人员开发了一种结合环介导等温扩增与侧流层析试纸条（LAMP-LFD）的检测方法，用于快
Insidiosum疫霉（Pythium insidiosum）作为腐皮病的致病因子，仍是热带和亚热带地区的重要病原体，在这些地区，诊断延迟往往与重症及不良临床结局相关。研究人员开发了一种结合环介导等温扩增与侧流层析试纸条（LAMP-LFD）的检测方法，用于快速检测P. insidiosum。该方法采用双标记的LAMP扩增子，可直接通过侧流层析试纸条进行检测，无需进行琼脂糖凝胶电泳即可实现简单的可视化判读。使用来自102株临床相关分离株的基因组DNA（gDNA）评估了分析性能，其中包括51株P. insidiosum分离株和51株非目标生物。LAMP-LFD检测正确识别了所有P. insidiosum分离株，包容性达到100.0%（95% CI：93.0–100.0%），并正确排除了51株非目标生物中的48株，排他性达到94.1%（95% CI：83.8–98.8%）。该方法展示了每反应10 fg gDNA的检测限，其分析灵敏度比参考的多重PCR（m-PCR）检测高至少1000倍。使用47份盲法动物组织标本进行临床验证，结果显示其灵敏度为90.3%，特异性为87.5%，准确率为89.4%，且与参考标准（培养和ITS序列分析）具有良好的一致性（κ = 0.76）。相比之下，m-PCR检测的灵敏度仅为41.9%，表明其临床检测性能显著较低。总之，基于LFD的直接检测保留了的已建立的P. insidiosum LAMP检测的分析性能，同时提供了清晰且易于判读的可视化终点。LAMP-LFD检测方法作为一种快速、敏感且实用的腐皮病筛查工具，提供了改进的诊断性能和更可靠的结果判读。
**研究背景与目的**
腐皮病是由类真菌的卵菌病原体Insidiosum疫霉引起的一种严重且可能致命的疾病，主要影响热带和亚热带地区的人类及多种动物。该病具有侵袭性进展快、对常规抗真菌药物反应有限和预后差等特点。诊断延误常导致患者错过最佳治疗时机，从而增加广泛手术干预（如截肢或眼球摘除）的风险。目前针对腐皮病的诊断方法主要包括常规培养、免疫学检测和核酸检测（NATs）。其中，环介导等温扩增（LAMP）因其简单、快速且扩增效率高，已被广泛应用于病原体检测。然而，传统LAMP产物的检测方法存在一定局限性：浊度法需要专用分光光度计读数器，琼脂糖凝胶电泳耗时费力，比色法虽能实现可视化但结果判读主观性强，在颜色变化较弱或处于临界值时极易产生误判，且观察者间差异较大，可能损害诊断可靠性。为克服这些局限，侧流层析试纸条（LFD）技术作为一种低成本、快速且易用的报告平台应运而生，其通过基于金纳米颗粒的信号生成，实现双标记LAMP扩增产物的直接可视化检测，产生易于判读的测试线。截至目前，尚无研究报道使用LAMP-LFD平台检测P. insidiosum。因此，本研究旨在开发一种用于快速检测P. insidiosum的LAMP-LFD方法，并将其灵敏度与特异度与成熟的m-PCR方法进行比较。本研究成果已发表在《Journal of Fungi》上，为腐皮病的筛查提供了一种快速、灵敏且实用的替代分子诊断工具，有效提升了诊断性能和结果判读的可靠性，具有重要的临床应用价值。
**关键技术方法**
本研究主要采用以下关键技术方法：首先，针对P. insidiosum核糖体DNA（rDNA）的内部转录间隔区（ITS）设计包含两条外侧引物、两条内侧引物及两条环引物在内的六条引物组，并在BIP和LB引物的5′端分别进行生物素和异硫氰酸荧光素（FITC）标记以生成双标扩增子；其次，结合Bst DNA聚合酶在恒温条件下进行LAMP扩增，并通过LFD试纸条实现直接可视化检测；最后，以多重PCR（m-PCR）为对照方法。样本队列来源于102株临床相关微生物分离株（含51株P. insidiosum及51株非目标生物）以及47份来自泰国某大学兽医微生物学与免疫学单位的盲法动物组织标本。所有结果均与参考标准（培养和ITS序列分析）进行统计学一致性比对。
**研究结果**
*原理与LAMP-LFD检测P. insidiosum的优化*
通过使用FITC和生物素标记的引物生成双标记LAMP扩增子，并用于随后的侧流层析试纸条检测，成功优化了检测P. insidiosum DNA的LAMP-LFD方法。带有FITC-生物素标记的扩增子与金纳米颗粒偶联的抗FITC抗体结合，通过毛细管作用在LFD试纸条上迁移，在测试（T）线处被固定的抗生物素抗体捕获并产生可见的红色信号，而在控制（C）线捕获过量的金标抗体以确认测试有效性。代表演化支I、II和III的三株P. insidiosum参考株均在LFD的T线和C线产生了清晰可见的条带，无模板对照仅在C线显示条带。该结果与琼脂糖凝胶电泳呈现的典型梯状条带模式相一致。
*LAMP-LFD的分析性能*
在分析特异性方面，通过对51株P. insidiosum、3种密切相关的腐霉以及48株临床相关非目标真菌的gDNA进行测试，LAMP-LFD检测成功检出全部51株P. insidiosum， Inclusivity（包容性）为100.0%（95% CI：93.0–100.0%）。但在51株非目标生物中，有48株被正确识别为阴性，3种密切相关的腐霉（P. aphanidermatum、P. catenulatum和P. rhizo-oryzae）出现交叉反应，排他性为94.1%（95% CI：83.8–98.8%）。相比之下，m-PCR正确鉴定了所有目标菌且未发生交叉反应。在分析灵敏度方面，LAMP-LFD方法对三个演化支参考株的检测限一致，均低至10 fg gDNA；而m-PCR的检测限为10 pg至100 pg。这表明LAMP-LFD的分析灵敏度较m-PCR提高了1000至10000倍。
*使用临床标本评估LAMP-LFD*
共评估了47份盲法动物临床标本（31份腐皮病样本和16份非腐皮病样本）。LAMP-LFD正确鉴定出28份阳性标本和14份阴性标本，产生3份假阴性和2份假阳性，灵敏度为90.3%，特异性为87.5%，总体准确率为89.4%，与参考标准（培养和ITS测序）的一致性Cohen's kappa系数为0.76，表现良好。相反，m-PCR仅正确鉴定出13份阳性标本，产生18份假阴性，灵敏度仅为41.9%，与参考标准的一致性仅为0.32。在临床检测性能上，LAMP-LFD显著优于m-PCR。
**讨论与研究结论**
本研究开发的LAMP-LFD检测法将LAMP的高分析灵敏度与免疫色谱侧流读出平台的简易性相结合。与研究人员前期开发的依赖琼脂糖凝胶电泳进行扩增子检测的LAMP方法不同，LFD形式无需扩增后电泳分析，可在约80分钟内直接判读结果，速度快于m-PCR。该方法表现出优异的分析性能，对涵盖所有三个演化支的P. insidiosum分离株具有完全的包容性。出现与三种相关腐霉交叉反应的原因，主要归因于目标引物序列在不同腐霉ITS区域间的高度保守性，而非LFD检测平台本身的缺陷。
LAMP-LFD超群的分析灵敏度在临床性能上得到了体现。在检测47份临床标本时，它检出的腐皮病阳性标本数量是m-PCR的两倍多，灵敏度远超m-PCR的41.9%。其高灵敏度得益于极低的检测限，能识别临床标本中由于病原体负荷低、分布不均或DNA降解产生的痕量DNA。与传统m-PCR相比，直接可视化读出简化了工作流程。与研究人员先前的比色法LAMP（c-LAMP）相比，LAMP-LFD直接检测双标记扩增子而非通过Mg2+耗竭引起的间接颜色变化，从而有效减少了c-LAMP中因弱扩增导致的颜色微弱或模糊产生的误判，灵敏度（90.3% vs 83.9%）、特异性（87.5% vs 68.8%）和准确率（89.4% vs 78.7%）均显著提升，且结果与琼脂糖凝胶电泳完全一致。
尽管有3份样本因病原负荷低等可能原因产生假阴性，2份非目标样本疑因污染或非特异性扩增产生假阳性，本研究仍展示了循序渐进的改良过程。但研究存在一定局限性：临床评估使用的动物标本数量相对较少，人类腐皮病检测性能尚待确定；特异性评估涵盖的腐霉种类有限；样本制备仍需提取gDNA，未来需探索更简化的前处理手段；且未与qPCR进行直接对比。综上所述，本研究成功建立了一种用于检测P. insidiosum的LAMP-LFD方法。结论表明，直接基于LFD的检测克服了以往LAMP形式的诸多局限，在保留极强分析灵敏度的同时提供清晰直观的可视化终点，大幅提高了临床灵敏度。该方法是一种实用且有效的腐皮病快速筛查工具，可用作缺乏qPCR等专业基础设施环境下的替代分子诊断手段。然而，鉴于假阳性结果及与相关腐霉的交叉反应，LAMP-LFD不应当作独立诊断手段，阳性结果需结合临床与实验室发现综合判读，并在必要时使用参考方法予以确证。
