利用原生质体融合选育早熟、优质的黑木耳菌株

《Journal of Fungi》：Breeding of Early Maturity, High-Quality Auricularia heimuer Strains Using Protoplast Fusion

　　

黑木耳（Auricularia heimuer）是中国重要的栽培食用菌。本研究以早熟、菊花形、高产菌株“8808”和晚熟、单片形、优质菌株“HW15”为亲本，旨在通过原生质体融合（protoplast fusion）开发兼具早熟与优良品质的黑木耳新菌株。采用聚乙二醇（PEG）介导法融合亲本原生质体，通过锁状联合（clamp connection）观察、拮抗试验（antagonism test）、酯酶同工酶（esterase isozyme）分析及简单序列重复间区（ISSR）分子标记技术鉴定获得的杂交体，并进一步通过栽培试验进行最终筛选。在评估的杂交体中，菌株R33表现出理想的农艺性状：原基形成比亲本HW15早4天，采收时间提前6天，产量提高14.7%，吸水率提高29.8%。转录组学分析显示，R33中淀粉和蔗糖代谢以及氨基酸代谢通路显著上调，这可能与其早熟和高产表型相关。总体而言，原生质体融合技术可用于创建兼具早熟、高产和优良品质的有前景的候选菌株。

**论文解读：利用原生质体融合技术选育早熟优质黑木耳菌株**

**研究背景与问题**
黑木耳（*Auricularia heimuer*）是中国第二大栽培食用菌，兼具食用与药用价值。随着产业快速发展，市场对黑木耳的产量和品质要求持续提高。选育早熟、高产、优质的新品种能显著缩短栽培周期、降低生产成本，成为当前育种工作的关键目标。然而，现有育种策略（如自然育种、杂交育种、诱变育种）存在周期长、杂交亲和性低等问题。原生质体融合技术可克服杂交不亲和障碍，实现遗传物质重组，已在灵芝、羊肚菌等食用菌中取得成效，但在黑木耳中研究相对有限。已有报道多聚焦于原生质体制备、再生条件优化及融合体系建立，缺乏以目标性状为导向的定向融合育种研究；杂交体筛选依赖表型观察，缺乏稳定高效的遗传标记辅助筛选体系；对杂交体的遗传稳定性、后代性状分离规律及杂种优势形成的分子机制缺乏系统研究，制约了优良融合菌株的精准育种和产业化应用。因此，本研究选择性状互补的两个亲本——早熟高产菌株“8808”和晚熟优质菌株“HW15”，通过原生质体融合实现早熟、高产、优质性状的定向整合，旨在解决现有品种中生长速率与品质难以平衡的产业难题，为拓宽黑木耳遗传基础、加速新品种选育提供理论依据和实践意义。

**主要关键技术方法**
本研究采用聚乙二醇（PEG）介导的原生质体融合技术，对亲本菌株8808和HW15进行灭活处理（热灭活和紫外灭活）后融合。通过荧光显微镜观察核相进行单核菌株筛选；利用拮抗试验、酯酶同工酶电泳（PAGE）及ISSR分子标记技术对融合子进行多层级鉴定；最终通过栽培试验（黑木耳菌袋栽培，每菌株15个生物学重复，共420袋，两轮独立重复）评估农艺性状。采用转录组测序（Illumina Novaseq 6000平台，参考基因组GCA_050574805.1）分析差异表达基因（DEGs），并利用qRT-PCR验证。

**研究结果**

**3.1 原生质体的制备与再生**
通过原生质体制备与再生技术获得亲本原生质体，在再生培养基中观察到原生质体形态。

**3.2 单核菌株的筛选与鉴定**
荧光显微镜观察：8808和HW15原生质体再生后分别获得200和220个候选菌株，经荧光染色初步筛选，分别保留73和100个菌株。拮抗试验：同一亲本与其两个单核菌株间存在明显拮抗线，而同一亲本不同核型单核菌株间拮抗不明显，据此鉴定出不同核型单核菌株（8808-D1、8808-D2、HW15-D1、HW15-D2）。酯酶同工酶分析：亲本与单核菌株共检测到多条谱带，单核菌株具有特异性条带，表明即使来源于同一亲本，两单核菌株间也存在差异。亲本菌丝生长速度快于其单核菌株，菌丝白色浓密，两单核菌株在菌丝生长速率和形态上存在差异。

**3.3 杂交体的制备、筛选与鉴定**
通过PEG介导融合获得80个菌株；经锁状联合鉴定、拮抗试验、酯酶同工酶分析及ISSR分子标记技术初步筛选，保留12个与亲本不同的菌株；经栽培复筛，9个菌株未形成原基，2个杂交体生长缓慢，最终获得生长较好的菌株R33。锁状联合观察表明R33为成功融合的双核菌株；拮抗试验显示R33与亲本间有明显拮抗线；酯酶同工酶聚类分析显示R33与亲本的遗传相似系数为0.52~0.67；ISSR扩增共获得97个多态性片段，R33继承自8808和HW15的特异性条带分别为6条和17条，丧失39条亲本特异性条带，另有6条为R33特有，表明R33是与亲本遗传差异显著的新菌株。R33的原基形成比HW15早4天，采收时间早6天，菌丝生长速率、菌丝定植时间、原基形成时间和采收时间均介于8808和HW15之间。

**3.4 农艺性状分析**

**3.4.1 质构分析（TPA）**
R33的吸水率比HW15高9.6%，比8808高29.8%；吸水率越高，质地越软，硬度、弹性、咀嚼性和回复力越低。R33的产量比HW15提高14.7%，但低于8808。

**3.4.2 耳片长度、宽度与色差分析**
8808子实体呈菊花形，HW15和R33呈单片形。R33的耳片长度和宽度均大于亲本。色差计测试显示，HW15的ΔE值最高，颜色变化最大；8808的ΔL值最低，颜色最深；三者的Δa和Δb值均为正值，表明耳片颜色偏红偏黄；HW15的Δb值最高，颜色最黄。

**3.5 转录组分析**
对亲本与杂交体共有的DEGs进行GO富集分析，显著富集于氧化还原酶活性、脂肪酸延伸和孢子形成。上调DEGs主要富集于氧化还原酶活性和孢子形成，下调DEGs富集于脂肪酸延伸、脂肪酸氧化和NADPH-血红蛋白还原酶活性。主成分分析（PCA）显示PC1贡献60.83%的变异，三组样本明显分离，组内重复差异极小。韦恩图显示8808-vs-R33有1586个DEGs，HW15-vs-R33有1754个DEGs，两者共享546个DEGs，这些共享DEGs主要富集于代谢通路，尤其是淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、苯丙氨酸代谢、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、组氨酸代谢等。8808-vs-R33中上调DEGs 659个，下调927个；HW15-vs-R33中上调525个，下调1229个。共享上调DEGs（73个）主要富集于甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢；共享下调DEGs（347个）富集于嘌呤代谢、戊糖和葡萄糖醛酸互变、半乳糖代谢。从上述通路中鉴定出6个关键基因：*CelC*（g10334）、*BglB*（g5007）、*GalM*（g2273）、*Hbd*（g9525）在R33中相对于亲本显著上调，*g1545*和*g2094*在8808-vs-R33中下调，但在HW15-vs-R33中均上调。*CelC*和*BglB*的上调可能促进纤维素高效转化为可利用的葡萄糖，*GalM*上调可能加速半乳糖转化为葡萄糖，*Hbd*上调可能增强脂肪酸β-氧化，为子实体形成提供能量。

**3.6 qRT-PCR验证**
选择6个基因进行qRT-PCR验证，结果与RNA-seq表达趋势定性一致，表明转录组数据可靠。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究通过原生质体融合成功获得了早熟高产优质的黑木耳新菌株R33，其原基形成时间比HW15早4天，采收时间早6天，产量提高14.7%，吸水率提高29.8%，杂交体成功整合了双亲的优良遗传特性，表现出正向杂种优势。转录组分析揭示，上调DEGs主要富集于氧化还原酶活性和孢子形成，提示菌株可能从营养生长转向生殖生长；淀粉和蔗糖代谢、氨基酸代谢通路上调为快速细胞分裂和细胞壁合成提供碳骨架和能量；下调DEGs富集于嘌呤代谢等，表明代谢重心从营养生长转向生殖生长。关键基因*CelC*、*BglB*、*GalM*、*Hbd*的上调可能分别增强纤维素降解、半乳糖转化和脂肪酸β-氧化，为菌丝和子实体生长提供充足碳源和能量。研究存在局限性：仅在一个环境条件下评价，未进行多区域多季节示范种植；杂交体的遗传稳定性和不同世代表型稳定性尚未系统评估。

**结论**
利用菌丝原生质体融合技术，以黑木耳8808和HW15为亲本生成杂交体，从形态、显微镜观察、拮抗试验、酯酶同工酶分析及ISSR分子标记等多角度多层次筛选鉴定。经栽培重复筛选，获得农艺性状更优的菌株R33。R33的原基形成时间比亲本HW15早4天，采收时间早6天，产量提高14.7%，吸水率提高29.8%。通过转录组学鉴定了可能与早熟相关的代谢通路，甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢通路中富集的基因最多，这是真菌利用多糖储备和调节细胞内糖稳态的核心通路。代谢通路的上调表达意味着杂交体可能更快地将培养基中的淀粉或蔗糖分解为葡萄糖等单糖，为细胞分裂和菌丝延伸提供物质和能量基础。总之，利用原生质体融合技术选育出有前景的候选菌株R33，不仅实现了产量、品质和生长周期的协同提升，也为原生质体水平的杂交育种提供了技术模型和理论参考。此外，通过转录组学分析亲本和杂交体中的DEGs，鉴定了与生长相关的关键代谢通路，为黑木耳分子育种奠定了基础。