《Agriculture》：Genome-Wide Characterization of the TaPR10/Bet v 1 Family Reveals Their Evolutionary Features and Hormone-Responsive Expression in Wheat
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小麦是全球重要的主粮作物，其生长和产量形成依赖于植物激素信号的精确调控。PR10/Bet v 1（病程相关蛋白10/疣桦1）家族由保守的小分子配体结合蛋白组成，参与植物激素信号传导和植物发育过程；然而，该家族在小麦中的系统性研究仍然有限。本研究对小麦中75个P
小麦是全球重要的主粮作物，其生长和产量形成依赖于植物激素信号的精确调控。PR10/Bet v 1（病程相关蛋白10/疣桦1）家族由保守的小分子配体结合蛋白组成，参与植物激素信号传导和植物发育过程；然而，该家族在小麦中的系统性研究仍然有限。本研究对小麦中75个PR10/Bet v 1家族成员进行了全基因组鉴定，并通过系统发育分析将其划分为三个亚家族：21个已知成员属于PYL（Pyrabactin resistance 1-like）亚家族，54个成员归属于两个此前未表征的亚家族。生物信息学分析表明，全基因组/片段重复驱动了该基因家族的扩增，且该家族在强纯化选择压力下进化。表达谱和启动子分析揭示了差异表达模式，以及丰富的响应多种激素的顺式作用元件。对12个代表性基因的定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析显示，在BR（油菜素内酯）、ABA（脱落酸）、CK（细胞分裂素）或SA（水杨酸）处理1小时内，多个成员的转录水平发生显著变化，表明这些基因可能直接参与激素调控过程。本研究为探索小麦PR10/Bet v 1家族的调控功能提供了基础框架，并为小麦农艺性状的遗传改良提供了有价值的激素响应候选基因。
小麦PR10/Bet v 1家族的全基因组特征解析与激素响应功能研究
一、研究背景与科学问题
小麦（Triticum aestivum L.）是全球种植范围最广、消费量最大的谷类作物之一，为全球超过三分之一的人口提供主要膳食热量来源。小麦的产量和品质等关键农艺性状从根本上受器官发生、形态建成和同化物积累等发育过程的支持，而这些过程由高度复杂的分子调控网络所协调。近年来，小麦生产面临生物和非生物胁迫的日益加剧的威胁，如极端天气事件更加频繁以及病原体对杀菌剂的抗性不断增强。因此，系统解析小麦生长发育的调控网络具有基础科学意义和实践价值，具体体现在培育高产优质小麦品种进而保障全球粮食安全方面。
病程相关（Pathogenesis-related，PR）蛋白是植物中一个庞大且高度多样的蛋白家族，其成员广泛参与植物整个生命周期中的环境胁迫响应和生长/发育调控。根据序列同源性和生化特性，植物PR蛋白被划分为17个家族。其中，PR10/Bet v 1家族是最大且功能最多样化的家族之一，因其兼具过敏原和发育调控因子的双重角色而受到广泛关注。PR10蛋白于20世纪80年代首次在欧芹和豌豆中被鉴定，后续研究表明该家族的同源物广泛分布于高等植物物种中。1989年，来自疣桦（Betula verrucosa）的主要花粉过敏原被克隆并确认与豌豆PR10蛋白具有高度序列同源性，因此被归入同一Bet v 1超家族。该家族的部分成员受生物胁迫诱导，而许多其他成员则在花粉和果实等组织中特异性积累，参与生殖发育和果实成熟。除经典PR10蛋白外，Bet v 1超家族还包括主要乳胶蛋白（major latex proteins，MLPs）和细胞分裂素特异性结合蛋白（cytokinin-specific binding proteins，CSBPs）等亚家族，二者均基于与Bet v 1的高度序列相似性被归入该超家族。基于结构的系统发育分析表明，Bet v 1样超家族包含多个蛋白家族，统称为SRPBCC（START/RHOαC/PITP/Betv1/CoxG/Calc）配体结合域超家族，其成员具有共同的进化起源，广泛分布于古菌、细菌和真核生物中，其中PR10/Bet v 1家族是植物中的主要形式。
核磁共振波谱观察显示，Bet v 1蛋白采用典型的α+β折叠结构，其内部的分叉疏水腔构成结合多种配体并实现功能多样性的核心结构基础。该家族成员通过配体结合活性深度参与多种生理过程，包括植物激素信号传导、生长发育和次生代谢。值得注意的是，PYR1/PYL/RCAR亚家族作为ABA受体，在ABA信号通路中发挥关键调控作用。然而，在小麦中，目前仅PYL亚家族被系统鉴定和功能表征，PR10/Bet v 1家族其他成员的生物学功能在很大程度上仍未被探索。基于此，研究人员开展了本项研究，旨在对小麦PR10/Bet v 1家族进行全基因组鉴定，系统分析其进化特征、基因结构和表达模式，为理解该家族在小麦发育中的调控作用奠定基础，并为小麦农艺性状的遗传改良提供候选基因。
二、主要技术方法
研究人员利用IWGSC RefSeq v1.1参考基因组数据，通过HMMER 3.3.2基于Bet v 1结构域（PF00407）的隐马尔可夫模型（HMM）谱进行全基因组局部同源搜索，并结合BLASTP比对（E值≤1×10??），经NCBI保守结构域数据库（CDD）验证后最终确定家族成员。使用MAFFT 7.490进行多序列比对，IQ-TREE 2.2.0构建最大似然（ML）系统发育树。利用MCScanX进行种内和种间共线性分析，计算同义替换率（Ks）和非同义替换率（Ka）及Ka/Ks比值以评估选择压力。采用MEME工具鉴定保守基序，PlantCARE数据库预测启动子顺式作用元件，并利用小麦eFP Browser获取RNA-seq表达数据。以小麦品种KN199（中国农业科学院作物科学研究所张立超教授实验室保存）为材料，对三叶期幼苗分别施加10 μM GA、20 μM CK、100 μM SA、50 μM ABA、0.05 μM BR和20% PEG-6000处理，在处理后1 h和24 h分别收取根和地上部组织，采用qRT-PCR检测12个代表性基因的表达变化。
三、研究结果
3.1 小麦TaPR10/Bet v 1家族的全基因组鉴定
利用IWGSC RefSeq v1.1参考基因组，研究人员共鉴定出75个含有典型Bet v 1结构域（Pfam登录号：PF00407）的基因，依据系统发育关系依次命名为TaPR10-1至TaPR10-75。系统发育分析将这75个基因划分为三个亚家族：亚家族III包含21个成员，全部属于TaPYL基因家族；亚家族I和II共包含54个此前未表征的成员。在38个已报道的TaPYL基因中，仅21个编码含完整Bet v 1结构域的蛋白，其余17个缺乏该核心结构域而被排除。54个TaPR10/Bet v 1蛋白的氨基酸长度范围为122至430个残基，分子量范围为16.19至48.30 kDa，等电点（pI）范围为4.3至5.6，表明这些蛋白均为酸性或弱酸性。疏水性分析显示大多数成员具有负的GRAVY值，为亲水性蛋白。亚细胞定位预测显示绝大多数TaPR10蛋白定位于细胞质，少数成员分别定位于线粒体、细胞核和质体。
3.2 TaPR10/Bet v 1基因在小麦中的染色体分布
染色体分布分析显示，TaPR10-1至TaPR10-54在小麦21条染色体上呈现高度聚集分布模式。绝大多数基因（29个成员）集中在第2同源群的染色体上，仅有少数散布在1B、3A、3B、3D、4A、4B、4D、5A、5B、7A、7B和7D染色体上。在1A、1D、6A、6B和6D染色体上未检测到该家族基因。在2A、2B和2D染色体上，家族基因聚集在染色体臂的远端区域，成员间物理距离相近且序列同一性高，表明这些染色体区域在进化过程中可能发生了串联基因复制事件。
3.3 共线性分析揭示TaPR10/Bet v 1家族的扩增机制
种内共线性分析共鉴定出94对由全基因组复制（WGD）/片段复制产生的旁系同源基因对和26对由串联复制产生的基因对。选择压力分析显示所有有效旁系同源基因对的Ka/Ks比值均低于1.0，表明该基因家族在进化过程中经历了强纯化选择。串联复制基因对的平均Ka为0.071，平均Ka/Ks比值为0.134；WGD/片段复制基因对的平均Ka为0.094，平均Ka/Ks为0.150，两种复制类型的Ka/Ks分布无显著差异（Mann-Whitney p = 0.64）。跨物种共线性分析进一步揭示了小麦与其二倍体祖先种乌拉尔图小麦（Triticum urartu）在A亚基因组上的高度保守直系同源关系，以及水稻和小麦在禾本科水平的保守共线性。小麦中PR10/Bet v 1基因在二倍体祖先种的2号同源染色体上已显示出明显富集，且该家族核心成员保留了跨物种的直系同源/共线性关系，表明其起源于核心成员分化之前的古老祖先位点，但家族规模主要由谱系特异性扩增（串联和多倍体复制）塑造。
3.4 TaPR10/Bet v 1蛋白的基因结构和保守基序分析
基于氨基酸序列同源性，54个TaPR10/Bet v 1家族成员被分为两个亚家族。外显子-内含子结构在各亚家族内总体保守，绝大多数基因由两个外显子和一个内含子组成。保守基序分析显示两个亚家族在基序组成上高度相似。在鉴定出的10个基序中，基序1、基序2和基序5为核心基序，存在于几乎所有家族成员中，位于蛋白序列的中央区域，对应典型的Bet v 1结构域。基序3为亚家族I特异性基序，仅在亚家族I中检测到。亚家族II则拥有更多样化的基序组合。基序5在两个亚家族中分布广泛，但位置排列存在显著差异：在亚家族I中位于蛋白序列的C端附近，而在亚家族II中则向N端移动。基序4为两个亚家族共有但在亚家族I中富集，而基序6主要分布于亚家族II。
3.5 小麦PR10/Bet v 1基因的表达谱和启动子分析
基于公共RNA-seq数据的表达热图分析揭示了亚家族I和亚家族II之间的明显表达模式差异。总体而言，亚家族I基因的转录本丰度普遍高于亚家族II基因。大多数亚家族I成员在根中高表达，部分在根、茎和叶中组成型高表达，少数呈现根特异性表达。相比之下，亚家族II呈现相反的表达趋势：大多数成员在茎、叶和穗等地上部组织中高表达，根中转录水平极低。仅有少数亚家族II成员在根中优势表达，但其表达水平显著低于亚家族I对应成员。这些结果表明TaPR10/Bet v 1家族成员呈现明显的组织表达差异，提示它们在小麦生长发育过程中可能具有不同的功能。启动子顺式作用元件分析共鉴定出101种类型的推定顺式元件（总计6022个），可分为生长发育相关元件、激素响应元件和胁迫响应元件三类。激素响应元件在该家族启动子中广泛分布，其中脱落酸响应元件（ABREs）和茉莉酸甲酯响应元件（TGACG和CGTCA基序）最为丰富，几乎存在于所有家族成员中。生长和发育相关元件相对较少，仅存在于部分成员中。
3.6 TaPR10/Bet v 1基因的激素响应表达分析
基于转录谱数据鉴定的组织表达模式差异，研究人员从两个亚家族中选取了12个代表性基因，分析了它们对多种植物激素和PEG处理的表达响应。根据表达模式将基因分为四组。第一组为亚家族I的TaPR10-14、TaPR10-15和TaPR10-16，在根中具有高基础表达，茎和中表达中等。在根中，三个基因均被SA和PEG处理强烈诱导，而在ABA或BR处理后24 h转录水平趋于下降。第二组为亚家族I的TaPR10-21、TaPR10-23和TaPR10-24，呈现严格的根特异性表达模式。在激素处理下，这三个基因在地上部中的转录水平在CK、ABA和BR处理后1 h被上调3.06至54.33倍。第三组为亚家族II的TaPR10-35、TaPR10-36和TaPR10-37，在根中基础表达极低但在茎、叶和穗等地上部组织中高表达。三个基因均在BR处理后24 h在根中被上调，TaPR10-35还在CK、SA和PEG处理后1 h在根中被显著诱导。第四组为亚家族II的TaPR10-43、TaPR10-44和TaPR10-45，主要在根中表达。TaPR10-44和TaPR10-45在BR处理后1 h在地上部中分别被上调32.72倍和57.71倍，CK处理也诱导了它们在地上部中的表达。TaPR10-43则表现出明显不同的响应模式，其表达受BR和CK影响较弱，但在地上部中于SA和ABA处理后24 h被上调。
四、讨论与结论
讨论部分指出，PR10/Bet v 1超家族广泛分布于古菌、细菌和真核生物中，其核心功能依赖于保守的疏水配体结合支架，但该家族在进化过程中经历了广泛的功能多样化，参与催化代谢和信号转导等多种生物学过程。在小麦中，该家族除PYL亚家族外其他成员的生物学功能在很大程度上仍未被表征。本研究的综合分析有助于阐明PR10/Bet v 1家族在小麦中的功能。作为异源六倍体作物，小麦经历了由多倍化驱动的大规模基因家族扩增。研究发现54个TaPR10/Bet v 1基因在染色体上呈高度聚集分布，超过一半成员集中在2A、2B和2D染色体长臂的远端，该基因簇在二倍体祖先种中已经形成。基因结构和保守基序分析揭示了两个亚家族间的结构和组成差异，不同的组织特异性表达模式进一步支持了功能分化的假说。顺式作用元件分析显示两个亚家族的启动子区域都富含大量激素响应元件，这与Bet v 1结构域的配体结合特性一致。在激素响应方面，BR诱导效应最为显著，5个基因在BR处理后1 h内在地上部中表现出9.91至57.71倍的表达变化，另有3个基因在BR处理后24 h于根中被上调8.18至25.05倍。进一步分析发现部分基因的转录受BR、CK和ABA共同调控，提示某些TaPR10/Bet v 1基因可能参与多种植物激素信号通路之间的交叉对话。
研究结论部分总结如下：本研究对小麦PR10/Bet v 1家族进行了全基因组鉴定，共鉴定出75个含有完整Bet v 1结构域的成员，经系统发育分析将其划分为三个亚家族。进化分析表明该基因家族在禾本科中高度保守，其在小麦中的扩增主要受祖先基因复制和多倍化事件驱动；在第2同源群染色体上的聚集分布是该家族的典型分布特征。序列和表达谱分析揭示了序列组织和表达模式的差异，与两个此前未表征亚家族之间可能的功能分化一致：亚家族I呈现高根特异性表达，在系统发育上与经典PR10蛋白更接近；而亚家族II在多个组织中呈现广谱表达，与MLP/CSBP型蛋白具有更高的序列同源性。两个亚家族在基因结构和保守基序组成上的差异为其功能分化提供了序列水平基础。qRT-PCR揭示了基因、组织和时间依赖性的BR及其他处理转录响应，为未来功能验证提供了候选基因。该研究为小麦PR10/Bet v 1家族的功能解析建立了系统框架，为小麦发育调控提供了关键候选基因，经进一步验证和功能研究后，可能为小麦改良和育种做出重要贡献。
