综述：CRISPR/Cas系统在呼吸道病原体诊断中的最新进展

《Viruses》：Recent Advances in CRISPR/Cas Systems for Respiratory Pathogen Diagnostics

　　

早期、快速且准确的检测对于由病原体引起的急性呼吸道感染（ARIs）的临床管理和流行病学控制至关重要。传统的检测方法，如微生物培养、血清学检测和聚合酶链式反应（PCR），在操作和物流方面存在限制，因此不易在即时检测（POCT）环境中使用。CRISPR/Cas系统是一种适应性原核免疫系统，由聚集规则间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas）组成，已被用作具有可编程序列特异性靶标识别和信号放大侧支切割活性的核酸诊断平台。现有的综述大多集中于Cas酶的分类或扩增策略；本综述采用以病原体为中心的方法，涵盖了病毒病原体（严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）、流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、人腺病毒（HAdV）和水痘-带状疱疹病毒（VZV））、细菌病原体（结核分枝杆菌（MTB）、肺炎链球菌（SP）、肺炎支原体（MP）和金黄色葡萄球菌（SA））以及真菌病原体（烟曲霉（AF）和耶氏肺孢子菌（PJ））。关键技术进展，如等温扩增偶联、单管集成反应设计、无扩增数字检测和电化学生物传感器集成，已在基于Cas9、Cas12和Cas13的系统中进行了评估，并概述了其机制基础。目前阻碍临床转化的挑战，如样本基质干扰、多重信号串扰、crRNA脱靶效应以及缺乏大规模验证研究，得到了批判性评估。同时，提出了便携式、集成化和低成本诊断平台的未来路径。

1. Introduction
急性呼吸道感染（ARIs）由病毒、细菌和真菌病原体引起，是全球发病率和死亡率的重要负担，需要可靠、快速的病原体鉴定以实现最佳临床护理和流行病学控制。当前依赖微生物培养、血清学和聚合酶链式反应（PCR）的诊断方法存在局限性：培养法对挑剔菌无效且周期长，血清学存在窗口期和交叉反应，PCR依赖热循环设备和专业操作人员，限制了其在即时检测（POCT）环境中的应用。CRISPR/Cas系统基于程序化序列特异性靶标识别和侧支切割活性，已发展为核酸诊断平台，其与等温扩增技术（如LAMP、RPA、ERA）兼容，灵敏度可达aM至zM范围。但扩增偶联CRISPR/Cas平台存在引物和crRNA设计复杂、试剂成本高、气溶胶污染导致假阳性等缺点，因此无扩增检测和一步法吸引了研究关注。此外，CRISPR/Cas技术还被改造用于非核酸靶标（如蛋白质、抗原抗体复合物、小分子代谢物）的检测，可适应呼吸道感染性疾病的快速诊断。现有综述多从检测技术或Cas效应蛋白分类，但鲜有从临床流行病学角度探讨CRISPR/Cas检测呼吸道病原体。本综述介绍了基于CRISPR/Cas的诊断系统分类及Cas9、Cas12、Cas13介导的检测机制，讨论了最新技术进展和挑战，并强调了在病毒、细菌和真菌呼吸道病原体检测中的潜在应用，为CRISPR检测领域的研究构建了统一框架。

2. Classification and Mechanism of the CRISPR/Cas System
CRISPR/Cas系统分为两大类：Class I利用多Cas蛋白复合体，Class II利用单Cas效应蛋白。Class I和Class II分别包括I、III、IV型和V、VI型（Cas9、Cas12、Cas13）。Class II结构简单，仅需一个Cas蛋白与crRNA形成功能性核糖核蛋白复合体（RNP），通过序列特异性crRNA设计实现精确靶标识别和切割。激活的Cas蛋白还能切割附近的单链核酸，产生可检测信号（侧支/非特异性切割）。Cas9、Cas12、Cas13是Class II中最常用的诊断效应蛋白。Cas9主要靶向双链DNA（dsDNA），通过单指导RNA（sgRNA，融合crRNA和tracrRNA）和RNP复合体识别与原型间隔子相邻基序（PAM）相邻的靶DNA，RuvC和HNH核酸酶结构域引入双链断裂（DSB），用于基因编辑；Cas9缺乏侧支切割活性，但高序列特异性使其在依赖靶标识别的诊断中有价值。Cas12系统（如Cas12a、Cas12b）由crRNA引导识别靶dsDNA，通过RuvC结构域进行顺式切割，激活后获得对单链DNA（ssDNA）的非特异性反式切割活性，该侧支活性是分子诊断的基础。Cas13a是一种RNA引导的核糖核酸内切酶（endoRNase），特异性切割单链RNA（ssRNA），激活后同样具有侧支切割活性，适合RNA病毒检测。Cas14是一种微RNA引导的核酸酶，偏好ssDNA且无需PAM序列。典型CRISPR-Cas诊断工作流程包括三个步骤：核酸提取和扩增以增加灵敏度；CRISPR/Cas识别和激活，包括靶核酸与Cas蛋白结合及特异性gRNA/crRNA激活核酸酶活性；信号报告，即活化CRISPR/Cas复合体识别靶核酸并切割预加的报告分子（荧光、比色或电化学标记），产生可检测的输出。

3. Application of the CRISPR/Cas System in Respiratory Pathogen Detection
3.1. Viral Respiratory Pathogens
3.1.1. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)
SARS-CoV-2为正义单链RNA病毒，其N蛋白、S蛋白等常作为检测靶标。实时定量RT-PCR（qRT-PCR）是金标准，但无法用于快速POCT筛查。CRISPR/Cas诊断系统提供了更高特异性和灵敏度。多项研究将CRISPR/Cas与等温扩增结合，如LAMP-Cas12a检测鼻咽/口咽拭子中的N和E基因，采用侧向层析试纸条或荧光读数，40分钟出结果，阳性一致率95%，阴性一致率100%，但存在工作流程复杂、依赖专用设备和试剂、脱靶扩增等缺点。为克服这些挑战，开发了集成系统，将扩增和CRISPR反应整合为单管一步法。Hu等构建双层物理分离反应管，内室进行RPA反应，离心或震荡后转移至外室与预存Cas13a试剂混合，无需开管，检测限3拷贝/μL，与qRT-PCR可比。Sun等将CRISPR反应混合物加载到管盖，RT-RPA在管底，离心混合，50分钟检测，检测限1拷贝/μL。Hu等开发光控CRISPR/Cas12a平台，RPA和Cas12a在密封管中分离，通过光照激活，智能手机解读结果，灵敏度90%，特异性100%，无需离心或混匀。Wang等开发整合CRISPR/Cas13a与微孔阵列核酸富集和单分子数字检测的平台，实现无扩增“样本进-结果出”单分子检测，避免扩增偏倚和气溶胶污染。

3.1.2. Influenza Virus
流感病毒分为A、B、C、D型，每年导致大量重症和死亡。Zhou等基于CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应（HCR）开发比色生物传感器检测H1N1，Cas13a切割探针RNA触发HCR级联放大，产生可见绿色信号，检测限0.152 pM，但存在成本高、脱靶和污染风险。Zhang等设计三维球形DNA纳米结构（3D-SDNC）整合CRISPR/Cas12a，无需核酸扩增，通过适配体结合H1N1病毒后激活Cas12a反式切割产生荧光信号，实现快速超灵敏检测。针对耐药株，Zhang等开发基于双Cas12a/Cas13a的SHINE平台，可区分H275Y耐药突变，用于抗病毒药物耐药性监测。H5N1高致病性禽流感病毒（HPAI）死亡率超50%，Li等整合重组酶介导核酸扩增、CRISPR-Cas13a和LFA技术，检测H5亚型，检测限0.1拷贝/μL，与qRT-PCR完全一致，无交叉反应。Guo等构建基于CRISPR/Cas12a的多模式生物传感平台，具荧光、侧向层析和便携式血糖仪三种信号输出，1小时内检测H5N1，检测限3.7×10²拷贝/μL，适合资源受限环境。

3.1.3. Respiratory Syncytial Virus (RSV)
RSV是婴幼儿、老年人和免疫缺陷者严重下呼吸道感染的主要病因。Tan等开发“一锅RPA-CRISPR/Cas12a”系统，用石蜡物理分离RPA和CRISPR/Cas12a，实现12种常见呼吸道病原体同时检测，包括SARS-CoV-2、流感病毒和RSV，减少气溶胶污染，但单管多重信号区分仍需优化。Wang等开发基于LbuCas13a的自级联循环扩增方法（SCC-Cas13a），设计含多个尿嘧啶残基的发夹探针，靶RNA激活Cas13a切割后释放RNA激活子，形成正反馈指数级信号放大，无需预扩增，3分钟内同时检测RSV、甲型流感病毒和SARS-CoV-2，集成智能手机辅助装置实现多重POCT。Li等开发无扩增Cas13a集成石墨烯场效应晶体管（gFETs），直接检测SARS-CoV-2和RSV基因组，无需扩增，检测限1 aM，提升速度和灵敏度。

3.1.4. Human Adenoviruses (HAdVs)
HAdV是儿童呼吸道感染常见病原体，可引起多系统感染。Gao等结合RPA和CRISPR/Cas检测系统，设计特异性引物和crRNA，实现RSV和HAdV双检，对RSV灵敏度98.1%，HAdV灵敏度91.4%，特异性100%，但引物与crRNA的相互作用是多重检测的挑战。Zhang等基于酶促重组酶扩增（ERA）扩增HAdV55基因，CRISPR/Cas12a信号增强靶向六邻体基因保守区，无需复杂设备，适用于快速POCT筛查。

3.1.5. Varicella-Zoster Virus (VZV)
VZV原发感染引起水痘，再激活导致带状疱疹，可伴严重并发症。Zhong等使用RPA扩增VZV gE基因，设计量子点纳米珠（QDNB）标记的侧向层析免疫层析检测，1小时内可视化结果，86例临床水疱样本与qPCR结果100%一致，无需核酸提取，适合资源受限地区快速筛查。

3.2. Bacterial Respiratory Pathogens
3.2.1. Mycobacterium tuberculosis (MTB)
结核病每年新增约1000万例。Gan等开发ERA-CRISPR/Cas12a检测系统快速鉴定MTB，特异性100%，荧光和侧向层析双模式，但两步法需手动转移扩增产物，增加污染风险。Peng等构建一步法结核检测系统，整合CRISPR/Cas12b和交叉引物扩增（CPA），检测痰液样本，检测限0.8拷贝/μL，灵敏度67.2%，特异性96.7%，Cas12b增强稳健性。Liao等开发dAFCas-TB平台，结合热裂解、微滴数字CRISPR和智能手机成像，单次检测成本低于1美元，灵敏度和特异性分别为97.7%和93.8%。针对耐多药结核（MDR-TB），Xiao等构建基于CRISPR/Cas14a的平台，同时检测利福平和异烟肼耐药，通过多重扩增rpoB、katG和inhA基因，分别用野生型和突变型引导RNA识别，荧光强度判断耐药状态，对利福平耐药检测灵敏度93.3%，特异性100%，异烟肼耐药灵敏度97.5%，特异性100%。

3.2.2. Streptococcus pneumoniae (SP)
肺炎链球菌是社区获得性肺炎、脑膜炎和中耳炎的重要病原体。Zhou等结合LAMP和Cas12a侧支切割活性，开发侧向层析免疫层析平台检测cpsA基因，35分钟出结果，23例临床样本验证总时间<1小时。Kan等开发单管掌上型CRISPR/Cas12a诊断平台（PaCD），同时检测SP、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌和肺炎支原体四种病原体，结合便携温控读取设备，30分钟完成，与二代测序结果100%一致。

3.2.3. Mycoplasma pneumoniae (MP)
肺炎支原体是儿童和成人上呼吸道感染的重要病原体。Deng等整合CRISPR/Cas12a与ERA，开发双模式检测平台（荧光和侧向层析），30分钟出结果，检测限1拷贝/μL，特异性100%。Nan等设计MP-MCDA-CRISPR系统，结合多重交叉置换扩增（MCDA）和CRISPR/Cas12a，1小时内完成，128例临床样本验证与qPCR结果一致。针对大环内酯类耐药（A2063G突变），Ren等基于RPA-CRISPR/Cas13a两步法检测，检测限10拷贝/μL，27例临床样本与测序结果完全一致。

3.2.4. Staphylococcus aureus
金黄色葡萄球菌是社区获得性肺炎和医院获得性肺炎的常见病原体，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）增加临床挑战。Xu等构建RPA-Cas12a荧光检测系统，靶向gE基因，30分钟等温扩增，检测限10拷贝/反应，无交叉反应。Mao等设计模块化微流控传感平台，整合核酸提取、CRISPR/Cas13a和电化学发光（ECL）读出，利用表面张力驱动过滤加速处理，多通道CRISPR/Cas13a同时靶标识别和信号放大，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为模型实现快速多重RNA检测。

3.3. Fungi Respiratory Pathogens
3.3.1. Aspergillus fumigatus
烟曲霉是免疫功能低下者侵袭性曲霉病的主要病原体。Lin等开发基于RPA-CRISPR/Cas12a的诊断方法，靶向β-微管蛋白基因，液体石蜡覆盖防止气溶胶污染，荧光或侧向层析读out，49例临床样本验证特异性100%，检测限10²拷贝/μL，但无法区分定植、污染和真正侵袭性感染。WHO已将烟曲霉列为高优先级真菌病原体，其cyp51A基因TR34/L98H突变导致唑类交叉耐药，未来可结合CRISPR多靶标检测策略整合耐药和病原体分析。

3.3.2. Pneumocystis jirovecii
耶氏肺孢子菌引起肺孢子菌肺炎（PJP），主要见于免疫缺陷患者。Wu等开发RPA-CRISPR/Cas12a系统，靶向线粒体mtSSU rRNA基因保守区，与15种常见呼吸道病原体无交叉反应，提供快速准确诊断，但样本量小且无法区分活动性感染和定植。Ulloa等开发无须核酸扩增的CRISPR-Cas12a检测平台，靶向DHPS、β-微管蛋白和mtLSU rRNA基因，20-30分钟产生荧光信号，成本低，适合资源有限环境。

4. Conclusions and Outlook
CRISPR/Cas系统因其特异性和可编程性，已成为检测多种呼吸道病原体的通用工具，结合SHERLOCK、DETECTR、SHINE等诊断平台，实现快速准确鉴定。与微流控、电化学生物传感器和DNA纳米机器结合，诞生了高灵敏度、高特异性甚至无扩增的检测方法，并支持多重检测和耐药标记。然而，临床推广仍面临障碍：(1)复杂的样本处理：多数工作流程仍依赖耗时的核酸提取步骤，虽然探索了免提取、一锅法、热裂解和微流控集成等方法，但不同样本类型（如鼻咽拭子、BALF、痰液）对CRISPR/Cas检测的抑制程度不同，标准化预处理方案仍缺乏。(2)脱靶和背景效应：Cas蛋白的非特异性侧支切割在信号放大同时可导致背景信号或脱靶，降低特异性，需优化crRNA设计、工程化高保真Cas变体和反应条件。(3)缺乏检测特异性和多重能力：呼吸道感染常为混合感染，需多重检测，但Cas12a和Cas13a的侧支切割可导致信号串扰和假阳性，当前方法多聚焦于改进crRNA和Cas蛋白，但系统验证仅限于临床重要病原体；RNA病毒（如SARS-CoV-2、流感病毒、RSV）的高突变率对检测设计构成挑战，需设计针对保守区的多crRNA面板并建立动态更新数据库。(4)临床验证和标准化不完善：CRISPR诊断技术仍处于早期，缺乏大规模多中心随机临床试验，Cas酶来源、crRNA设计和信号读出方式（荧光、比色、电化学）的差异降低了研究间的可比性，目前尚无获批的常规体外诊断（IVD）产品。未来需进行大规模多中心随机对照试验，建立标准化操作流程和质量控制体系，并接受系统性监管审查。尽管挑战存在，CRISPR/Cas系统在呼吸道病原体检测中显示出巨大潜力，通过工程化酶、集成样本处理和多重检测策略，在可行性和实用性上取得显著进展。进一步降低成本、简化流程，如优化CRISPR反应体系、核酸提取步骤、开发冻干试剂，以及集成微流控芯片、等温扩增平台或便携式/智能手机读数系统，将有助于创建全集成手持式POCT设备，加速病原体快速诊断、合理使用抗菌药物和加强疾病监测基础设施。