综述：15种JEV抗原导向兔抗血清与三种临床重要JEV血清群成员（WNV、MVEV和SLEV）的交叉反应性

《Viruses》：Cross-Reactivity of 15 JEV Antigen-Directed Rabbit Antisera with Three Clinically Important JEV Serogroup Members: WNV, MVEV, and SLEV

　　

早期、快速且准确的检测对于由病原体引起的急性呼吸道感染的临床管理和流行病学控制至关重要。传统检测方法如微生物培养、血清学检测和PCR在操作和物流方面存在限制，因此不易在护理点使用。CRISPR/Cas系统是一种适应性原核免疫系统，由成簇规则间隔短回文重复序列及其相关蛋白组成，已被用作具有可编程序列特异性靶标识别和信号放大附带切割活性的核酸诊断平台。现有综述大多聚焦于Cas酶的分类或扩增策略；在本综述中，研究人员采用以病原体为中心的方法，涵盖了病毒病原体（SARS-CoV-2、流感病毒、RSV、HAdV和VZV）、细菌病原体（结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus））以及真菌病原体（烟曲霉（Aspergillus fumigatus）和耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii））。研究人员评估了基于Cas9、Cas12和Cas13的系统中的关键技术进展，如等温扩增耦合、单管集成反应设计、无扩增数字检测和电化学生物传感器集成，并概述了其机制基础。研究人员严格评估了目前阻碍临床转化的挑战，如样本基质干扰、多重信号串扰、crRNA脱靶效应以及缺乏大规模验证研究。同时，研究人员提出了便携式、集成化和低成本诊断平台的未来路径。

**1. 引言**
由病毒、细菌和真菌病原体引起的急性呼吸道感染（ARIs）在全球发病率和死亡率中构成重大负担，需要可靠、快速的病原体识别以实现最佳临床护理和流行病学控制。当前依赖微生物培养、血清学和聚合酶链反应（PCR）的诊断方法存在局限性。基于培养的方法对难养生物可能无效，且需要较长的孵育时间。血清学检测在感染早期存在诊断窗口期，且易发生交叉反应，导致假阳性结果。PCR的高灵敏度和特异性受限于热循环设备和训练有素实验室人员的需求，难以在快速、分散的临床环境中应用。这些局限性凸显了对适用于护理点和/或非实验室应用的快速、准确且灵活的诊断平台的需求。
CRISPR/Cas系统已被开发为基于程序化序列特异性靶标识别和附带靶标切割活性的核酸检测系统。其与等温扩增技术（如环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）和酶促重组酶扩增（ERA））的兼容性使其灵敏度达到attomolar（aM）和zeptomolar（zM）范围。扩增耦合的CRISPR/Cas平台存在若干实际缺点，如复杂的引物和crRNA设计、较高的试剂成本以及因气溶胶污染导致的假阳性风险。为克服这些挑战，无扩增的CRISPR/Cas检测系统和一步式检测格式吸引了越来越多的研究关注。除核酸检测外，CRISPR/Cas技术也被改造用于非核酸（NNA）靶标，如蛋白质、抗原-抗体复合物和小代谢分子，并可进一步适应于呼吸道传染病的快速诊断应用。
目前大多数CRISPR/Cas诊断综述集中于多重耐药临床细菌、食源性病原体或RNA病毒，并根据检测技术或Cas效应蛋白进行分类。然而，很少有研究从临床流行病学角度探索CRISPR/Cas用于呼吸道病原体检测。在本综述中，研究人员介绍了不同类型的CRISPR/Cas诊断系统以及Cas9、Cas12和Cas13介导检测的机制；讨论了近期技术进展和挑战；并强调了基于CRISPR/Cas的检测在病毒、细菌和真菌呼吸道病原体中的潜在应用，为基于CRISPR的检测领域的进一步研究创建了一个统一框架。

**2. CRISPR/Cas系统的分类与机制**
CRISPR/Cas系统可分为两大类：I类系统利用多Cas蛋白复合物，II类系统使用单一Cas效应蛋白。I类和II类分别包含I、III、IV、V和VI型（Cas9、Cas12和Cas13）。II类系统结构更简单，仅需一个Cas蛋白与crRNA形成功能性核糖核蛋白复合物。通过序列特异性crRNA设计实现精确靶标识别和切割。当Cas蛋白被激活时，它们还能切割附近的单链核酸，产生可检测信号用于诊断应用，这一现象称为附带（非特异性）切割。这种简单性使得II类系统在基因编辑和分子诊断中得到广泛应用。Cas9、Cas12和Cas13是II类系统中最常用的诊断效应蛋白。Cas9主要靶向双链DNA（dsDNA），通过与单导向RNA（sgRNA）形成的核糖核蛋白（RNP）复合物发挥作用，sgRNA是CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）的融合体。sgRNA引导Cas9识别靶标DNA序列邻近的原间隔序列相邻基序（PAM），之后RuvC和HNH核酸酶结构域引入双链断裂（DSB），实现基因编辑。尽管Cas9缺乏附带切割活性，但其高序列特异性使其在依赖靶标识别的诊断应用中具有价值。Cas12系统（如Cas12a、Cas12b）表现出与Cas9不同的切割机制。在crRNA引导下，Cas12识别靶标dsDNA并通过其RuvC结构域介导位点特异性切割，称为顺式切割活性。在靶标识别和激活后，Cas12a获得针对单链DNA（ssDNA）的非特异性反式切割活性。这种附带切割活性是其广泛用于分子诊断的基础。Cas13a是一种RNA引导的内切核糖核酸酶（endoRNase），可特异性切割单链RNA（ssRNA）。与Cas12类似，它被激活后表现出附带切割活性，使其非常适合RNA病毒的检测。Cas14是一种微RNA引导的核酸酶，偏好ssDNA且不需要PAM序列，是核酸检测的另一种选择。常用II类Cas效应蛋白的性质和差异已总结，并在呼吸道病原体检测背景下进行了比较。
典型的CRISPR-Cas诊断工作流程包括三个连续步骤：核酸提取和扩增以提高灵敏度；CRISPR/Cas识别和激活，包括靶标核酸与Cas蛋白结合以及特异性gRNA/crRNA结合以激活核酸酶活性；信号报告，涉及靶标核酸被激活的CRISPR/Cas复合物识别并切割预添加的含有荧光、比色或电化学标签的报告分子，产生可通过荧光计、目视检查或电化学检测平台检测的输出。

**3. CRISPR/Cas系统在呼吸道病原体检测中的应用**
随着基于Cas9、Cas12和Cas13的检测平台改进，CRISPR/Cas技术已广泛用于检测多种呼吸道病原体，包括病毒、细菌和真菌。这些方法在诊断灵敏度、速度和准确性方面提供了优势。
**3.1. 病毒性呼吸道病原体**
**3.1.1. 严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）**
SARS-CoV-2是一种正义单链RNA病毒，其基因组编码四种结构蛋白：核衣壳（N）、膜（M）、刺突（S）和包膜（E）。其中，S和N蛋白通常用作SARS-CoV-2检测的靶标。目前，实时定量RT-PCR（qRT-PCR）被认为是检测SARS-CoV-2的“金标准”。然而，在实际应用中存在一些局限性，该技术无法用于快速护理点筛查或大规模检测。CRISPR/Cas诊断系统提供了更高的特异性和灵敏度，已成为检测SARS-CoV-2的关键工具。
为检测SARS-CoV-2，多项研究将CRISPR/Cas系统与等温扩增方法结合，产生高灵敏度核酸检测策略。LAMP与基于Cas12的检测结合，可同时从鼻咽和口咽拭子中进行RNA逆转录和等温扩增。该方法靶向SARS-CoV-2的N和E基因以及作为内参的人RNase P基因，通过侧流层析试纸条或荧光读数检测信号，与qRT-PCR相比，阳性符合率为95%，阴性符合率为100%，约需40分钟获得结果。由于等温扩增，该检测快速、准确，且可多种格式读出，但存在与qRT-PCR共有的缺点：需要相对复杂的工作流程，依赖专用设备和试剂，并可能发生脱靶扩增。
为应对这些挑战，开发了将扩增和CRISPR反应整合到单一工作流程中的集成系统。这些方法依赖于物理分离技术或优化反应条件实现一管检测。Hu等人构建了双层物理分离反应管用于一管检测SARS-CoV-2。RPA反应在内室进行，其底部设有两个疏水孔，反应扩增后通过离心或摇动转移至外室，外室预存Cas13a试剂，实现无需开管的核酸检测。该检测的检测限为3拷贝/μL，与qRT-PCR相当，无需特殊仪器，缩短了检测时间并降低了成本。同样，Sun等人将CRISPR反应混合物加载到反应管盖上，RT-RPA混合物加载到管底，两者扩增后通过离心混合。该系统可在50分钟内检测SARS-CoV-2，检测限为1拷贝/μL。Hu等人进一步开发了光控CRISPR/Cas12a检测平台，其中RPA和CRISPR/Cas12a组分在密封管内分离，crRNA保持失活状态以防止扩增过程中Cas12a提前激活，RPA完成后通过光照激活CRISPR/Cas12a系统，并使用智能手机应用程序解读结果，与qRT-qPCR相比，灵敏度为90%，特异性为100%，消除了手动中间步骤，降低了污染风险，提高了自动化或护理点检测（POCT）的适用性。
Wang等人开发了将CRISPR/Cas13a与微孔阵列核酸富集和单分子数字检测相结合的集成检测平台。磁珠从大体积样本中捕获并浓缩靶标，靶标触发的CRISPR/Cas13a切割反应被分隔到数百万个飞升大小的微孔中，增强了局部信号强度，实现SARS-CoV-2的“样本进结果出”无扩增单分子检测，显著提高了灵敏度，并缓解了传统方法中扩增偏差和气溶胶污染两大问题。
**3.1.2. 流感病毒**
流感病毒是导致全球大流行和季节性流感的主要病原体，分为A、B、C和D型。据WHO估计，流感每年在全球导致300-500万重症病例和约29-65万呼吸系统疾病相关死亡。快速识别流感病毒对有效疫情预防和控制至关重要。Zhou等人开发了一种基于CRISPR/Cas13a系统与杂交链式反应（HCR）结合检测H1N1流感病毒的比色生物传感器。Cas13a介导的探针RNA切割触发HCR级联反应，产生可见的绿色比色信号，检测限为0.152 pM，通过链式反应信号放大提高了灵敏度、特异性和视觉读出能力，但存在成本较高、Cas蛋白可能脱靶以及污染导致假阳性的缺点。Zhang等人设计了一种基于三维球形DNA纳米结构（3D-SDNC）与CRISPR/Cas12a系统集成的无核酸荧光生物传感器，用于快速超灵敏检测H1N1流感病毒。该生物传感器由六个ssDNA分子组装成3D-SDNC框架，每个顶点功能化H1N1特异性适配体和Cas12a激活链。H1N1病毒存在时，适配体-病毒结合诱导构象变化，激活Cas12a/crRNA复合物，反式切割荧光标记报告探针，产生放大的荧光信号，最终通过测量荧光强度确定病毒存在。该研究将DNA纳米技术与CRISPR传感结合，为早期流感检测和开发更稳定的生物传感器提供了新型诊断平台。
此外，在耐药菌株流行增加的背景下，流感病毒序列数据的重要性日益凸显。奥司他韦是一种神经氨酸酶抑制剂，仍是季节性流感最广泛处方的抗病毒药物，但神经氨酸酶基因中的单核苷酸多态性（SNP）导致H275Y氨基酸替换，赋予H1N1甲型流感病毒奥司他韦耐药性。为应对这一挑战，Zhang等人开发了基于双Cas12a/Cas13a检测系统的SHINE平台，能够区分H275Y耐药突变的两等位基因，从而快速识别奥司他韦耐药菌株，为流感病毒抗病毒耐药监测提供了新工具，并可能帮助临床医生在护理点做出更明智的治疗决策。
H5N1高致病性禽流感（HPAI）病毒于1996年首次在中国广东省家禽中检测到，自出现以来已逐渐扩散至亚洲、欧洲、非洲甚至南极洲，驱动跨物种传播和区域流行。到2025年，流行病学数据显示H5N1感染死亡率超过50%。在此背景下，开发快速准确的检测方法对早期病例识别和疫情控制具有重要的公共卫生意义。基于CRISPR/Cas的侧流层析检测（LFA）已成为一种有前景的方法。Li等人将重组酶介导的核酸扩增与CRISPR-Cas13a系统和LFA技术整合，在临床标本中实现了H5亚型禽流感病毒的高灵敏度检测，检测限为0.1拷贝/μL，与qRT-PCR结果完全一致，且与其他亚型（H3、H7、H9和H10）无交叉反应。在此基础上，Guo等人构建了基于CRISPR/Cas12a的多模式生物传感平台，具备三重信号读出能力，可在1小时内检测H5N1病毒，检测限为3.7×10²拷贝/μL，支持荧光、侧流层析试纸条和便携式血糖仪三种独立信号输出模式，增强了在资源有限环境中的部署灵活性。CRISPR系统固有的特异性和LFA的操作简便性使该策略特别适合护理点检测应用，尽管基于CRISPR的HPAI-LFA产品尚未商业化，但转化研究持续推进该技术的实际实施。
**3.1.3. 呼吸道合胞病毒（RSV）**
RSV是婴儿、老年人和免疫低下人群严重下呼吸道感染的主要原因。CRISPR/Cas系统在RSV检测中也表现出强劲性能。近年来，RPA与CRISPR/Cas平台的整合使得快速、高特异性RSV诊断系统的开发成为可能。Tan等人开发了一种“一管RPA-CRISPR/Cas12a”系统，可同时检测12种常见呼吸道病原体，包括SARS-CoV-2、流感病毒和RSV。该设计中，石蜡用于物理分离RPA和CRISPR/Cas12a组分，确保在CRISPR激活前靶标序列充分扩增。该系统突出了CRISPR/Cas平台用于多重病原体检测的潜力，对区分细菌和病毒感染以支持合理抗生素使用具有重要意义。一管格式降低了气溶胶污染风险，但病原体识别仍依赖预分装试剂或重复检测，真正的单管多重信号区分仍需进一步优化。Wang等人基于LbuCas13a开发了自级联循环扩增方法（SCC-Cas13a），设计了含多个尿嘧啶残基的发夹探针，靶标RNA激活Cas13a切割探针后释放与靶标序列相同的RNA激活剂，触发新一轮CRISPR激活，形成正反馈回路，无需预扩增即可实现指数级信号放大。该方法可在3分钟内同时检测RSV、甲型流感病毒和SARS-CoV-2，与智能手机辅助设备集成，实现了临床鼻咽拭子样本中呼吸道病毒的多重护理点检测，为资源有限环境下快速呼吸道病毒筛查提供了有力工具。Li等人开发了基于Cas13a集成石墨烯场效应晶体管（gFETs）的无扩增核酸检测平台，无需预扩增即可直接检测SARS-CoV-2和RSV基因组。该系统中，Cas13a识别靶标RNA激活对石墨烯表面固定RNA报告分子的非特异性切割，导致gFET中可测量的电信号变化，检测限达1 aM，显著提高了检测速度和灵敏度，缩短了总检测时间。
**3.1.4. 人腺病毒（HAdVs）**
HAdVs是儿童呼吸道感染的常见原因，约占儿童下呼吸道感染的5-10%，也可引起多系统感染，包括呼吸道、眼部和胃肠道疾病。Gao等人将RPA与CRISPR/Cas检测系统结合，基于多重序列比对设计特异性引物和crRNA，实现RSV和HAdVs的双重检测。在160份临床咽喉鼻咽拭子样本中，对RSV的灵敏度为98.1%，对HAdV的灵敏度为91.4%，两者特异性均为100%（与qPCR相比）。双靶标扩增策略有助于简化工作流程并提高检测效率，但引物与crRNA之间的相互作用仍是多重检测开发的重要挑战。Zhang等人基于酶促重组酶扩增（ERA）扩增HAdV55基因，结合CRISPR/Cas12a介导的信号增强，靶向六邻体基因保守区，开发了HAdV55检测方法。该系统使用质粒标准和不同稀释度的培养菌株进行验证，优化了引物和crRNA以评估分析灵敏度，具有高灵敏度和特异性，无需复杂仪器，可用于护理点快速筛查。
**3.1.5. 水痘-带状疱疹病毒（VZV）**
VZV的自然宿主是人类，全球感染率超过90%，初次感染引起水痘，后期可重新激活（尤其在老年人和免疫低下患者中）导致带状疱疹，并可能引起严重并发症如脑膜炎和脑炎。Zhong等人使用RPA扩增VZV gE基因，并设计了基于量子点纳米珠（QDNB）标记的侧流免疫层析检测，结果可在1小时内可视化，对86份临床水疱样本的评估显示与qPCR结果100%一致。Cas12a-QDNBs系统具有样本用量少的优势，可在无需核酸提取的情况下准确检测，适用于资源受限地区的快速筛查。
**3.2. 细菌性呼吸道病原体**
**3.2.1. 结核分枝杆菌（MTB）**
肺结核由结核分枝杆菌单一病原体引起，全球每年约1000万新发病例和约150万死亡病例。WHO估计2023年全球新发结核病病例820万例。Gan等人开发了ERA-CRISPR/Cas12a检测系统用于快速鉴定MTB，特异性为100%，与其他呼吸道病原体或非结核分枝杆菌无交叉反应。Cas12a用于靶向MTB DNA，同时具备荧光和侧流层析两种读出模式，双模式格式实现了实验室高灵敏度和护理点快速筛查，但两步协议仍涉及扩增产物的手动转移，增加了操作复杂性并可能导致污染。Peng等人构建了一步式结核病检测系统，将CRISPR/Cas12b与交叉引物扩增（CPA）整合用于痰液样本中结核病检测，提高了诊断效率并简化了工作流程，使核酸扩增和CRISPR检测序列更便捷，最小化了交叉污染风险。该检测对H37Rv基因组DNA的检测限为0.8拷贝/μL，灵敏度为67.2%，与非结核分枝杆菌或其他呼吸道病原体无交叉反应，特异性为96.7%。Cas12b的使用进一步增强了稳健性和检测效率。Liao等人开发了dAFCas-TB平台，结合热裂解、微滴数字CRISPR和智能手机辅助成像，满足了可及性和低成本诊断需求。对58份MTB样本的临床评估显示灵敏度为97.7%，特异性为93.8%，每测试成本低于1美元，适合资源有限环境下的大规模筛查，有助于开发快速、准确且经济的基于CRISPR的结核病诊断工具。多重耐药结核病（MDR-TB）的日益流行对准确识别耐利福平（RFP）和异烟肼（INH）的结核分枝杆菌复合群（MTBC）菌株提出了迫切需求。Xiao等人构建了基于CRISPR/Cas14a的平台，同时检测MTB的RFP和INH耐药性。该系统在单一多重反应中共同扩增rpoB、katG和inhA基因，扩增产物转移至预加载Cas14a、指导RNA、T7核酸外切酶和荧光报告分子的独立腔室，使用荧光微孔板读取结果。设计两种指导RNA（gRNA-WT和gRNA-M）分别特异性识别野生型和突变等位基因，通过荧光强度确定耐药状态。在60份临床分离株的验证实验中，该检测对RFP耐药检测的灵敏度为93.3%，特异性为100%；对INH耐药检测的灵敏度为97.5%，特异性为100%。
**3.2.2. 肺炎链球菌（SP）**
肺炎链球菌是引起社区获得性肺炎、脑膜炎和中耳炎的重要病原体。Zhou等人将LAMP与Cas12a附带切割活性结合，开发了用于检测SP cpsA基因的侧流免疫层析平台，用于检测临床呼吸道样本中的SP和甲型流感病毒，检测在35分钟内完成。在23份支气管肺泡灌洗液和鼻咽拭子样本中验证了可行性和诊断性能，核酸提取后经LAMP扩增，再使用CRISPR/Cas12a荧光检测系统检测，总检测时间小于1小时，适合快速现场检测。Kan等人开发了单管、手掌大小的CRISPR/Cas12a诊断平台（PaCD），以进一步提高灵敏度、简化工作流程、降低污染风险并增加多重检测能力。该系统可在同一反应容器中同时检测SP、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌和肺炎支原体四种病原体，结合便携式温控读出设备，整个诊断工作流程仅需30分钟，增加了护理点检测的可行性。PaCD系统与下一代测序结果100%一致，显示了其在多重呼吸道病原体检测中的临床实用性。
**3.2.3. 肺炎支原体（MP）**
肺炎支原体是儿童、青少年和成人上呼吸道感染最重要的病原体之一，通常表现为干咳、发热和胸部不适。Deng等人将CRISPR/Cas12a与ERA整合，创建了用于MP检测的双模式检测平台，具备荧光和侧流层析两种模式，检测结果约30分钟可获得。在92份样本的临床评估中，该系统实现了100%特异性和1拷贝/μL的检测限。该研究首次提出ERA与CRISPR/Cas12a成功结合用于MP检测，展示了等温扩增-CRISPR混合策略在快速核酸检测中的潜力。随后，Nan等人设计了MP-MCDA-CRISPR系统，结合多重交叉位移扩增（MCDA）和CRISPR/Cas12a检测，整个过程小于1小时，集成了样本裂解、MCDA和CRISPR检测。在128份临床样本的验证中，对qPCR阳性和阴性样本分别获得50个正确阳性和78个正确阴性结果，该系统增强了临床适用性，推动了等温扩增-CRISPR系统在MP诊断中的转化。大环内酯类抗生素仍是儿童肺炎支原体肺炎治疗的基石，但近年来大环内酯耐药性的日益流行已成为难治性肺炎的主要原因。携带23S rRNA基因A2063G突变的MP菌株尤其值得关注，与严重疾病表现、并发症增加和长期后遗症密切相关。因此，迫切需要一种同时具备MP检测和A2063G突变识别能力的灵敏、快速、可靠的诊断方法，以支持早期鉴别诊断和指导合理抗生素选择。Ren等人在其先前建立的一步式RPA-CRISPR/Cas13a荧光检测基础上，开发了一种两步检测系统，专门用于识别A2063G大环内酯耐药突变，检测限为10拷贝/μL。在27份临床标本中测试时，该检测与测序数据完全一致，验证了基于RPA-CRISPR/Cas13a的平台同时检测MP核酸和A2063G耐药突变的实用性。
**3.2.4. 金黄色葡萄球菌**
金黄色葡萄球菌是社区获得性肺炎、医院获得性肺炎和呼吸道合并感染的常见原因，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的出现增加了临床挑战。Xu等人构建了针对金黄色葡萄球菌gE基因的RPA-Cas12a荧光检测系统，可在30分钟内完成等温扩增，通过Cas12a-crRNA介导的FAM标记报告探针切割产生荧光信号，检测限为10拷贝/反应，与常见呼吸道病原体无交叉反应，显示出快速筛查呼吸道感染的潜力。Mao等人设计了一种模块化微流控传感平台，结合核酸提取、CRISPR/Cas13a和电化学发光（ECL）读出，利用表面张力驱动过滤策略加速样本处理，多通道CRISPR/Cas13a系统用于同时靶标识别和信号放大，封闭双极电极ECL配置简化了操作并提高了分析灵敏度。该一体化平台以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为模型靶标，实现了快速RNA多重检测。
**3.3. 真菌性呼吸道病原体**
**3.3.1. 烟曲霉（Aspergillus fumigatus）**
烟曲霉是一种存在于土壤和人类频繁接触场所的丝状腐生真菌，对环境胁迫具有高耐受性和持久性。在免疫低下个体中，吸入的孢子可在宿主组织中持续存在并增殖，引起各种形式的侵袭性曲霉病，包括肺曲霉病、脑膜炎和心内膜炎，极端情况下可能致命。传统真菌培养技术耗时且灵敏度低，限制了其在真菌感染早期诊断中的用途。Lin等人开发了基于RPA-CRISPR/Cas12a的诊断方法，通过靶向β-微管蛋白基因检测肺部烟曲霉。该系统结合等温扩增和Cas12a单链DNA信号生成，通过在反应混合物上放置液体石蜡减少开管时的气溶胶污染，随后通过荧光或侧流层析试纸条读出。在49份临床样本（以qPCR为参考）的验证中，特异性为100%，检测限为10²拷贝/μL，克服了传统检测灵敏度低和周转时间长的局限性，但无法区分定植、污染和真正侵袭性感染。2022年，WHO将烟曲霉列入高优先级真菌病原体名单，主要是由于其疾病负担重和抗真菌耐药性增加。cyp51A中的TR34/L98H突变是唑类耐药的一个明确机制，这种突变赋予对最广泛使用抗真菌药物的交叉耐药性，使治疗策略更加困难。未来可结合基于CRISPR的多靶标检测策略进行耐药性和病原体综合分析，随着耐药机制知识的不断积累而发展。
**3.3.2. 耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii）**
耶氏肺孢子菌是引起肺孢子菌肺炎（PJP）的病原体，主要见于免疫低下人群，仍是与发病率和死亡率相关的重要机会性病原体，尤其是在获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者中。Wu等人开发了针对耶氏肺孢子菌线粒体mtSSU rRNA基因保守区的重组酶聚合酶扩增（RPA）-CRISPR/Cas12a系统，靶标扩增后通过Cas12a介导的报告探针切割产生诊断信号，与15种其他常见呼吸道病原体（包括