《Life》：Comparative Genomic and Transcriptomic Analyses of 60Co-Mutagenized Scheffersomyces stipitis Strains: Identification of Candidate Genes Associated with High-Ethanol-Producing Xylose-to-Ethanol Fermentation
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甘蔗渣是一种重要的可再生木质纤维素资源，但其生物转化效率仍然较低，主要原因是野生型酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）不能利用木糖，这限制了纤维素乙醇的工业化生产。在本研究中，通过60Co诱变和长期驯化，从树干毕赤酵母（Scheffer
甘蔗渣是一种重要的可再生木质纤维素资源，但其生物转化效率仍然较低，主要原因是野生型酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）不能利用木糖，这限制了纤维素乙醇的工业化生产。在本研究中，通过60Co诱变和长期驯化，从树干毕赤酵母（Scheffersomyces stipitis，原名毕赤酵母Pichia stipitis）1960中获得了一株高乙醇产率菌株31.1。菌株31.1的乙醇生产率为0.78 g/(L·h)，糖-乙醇转化率为0.38 g/g，发酵效率为82.61%。以野生型菌株1960和低产菌株12.1为对照，研究人员采用比较基因组学和转录组学来阐明高乙醇生产的机制。研究人员发现如下：在基因组水平上，存在271个基因组结构变异。在转录组水平上，大多数参与次级代谢产物合成、抗生素合成、核糖体途径、氨基酸生物合成和氧化磷酸化途径的基因均下调。此外，两个关键基因——XYL1（木糖还原酶基因）和XUT4（高亲和力木糖转运蛋白基因）显著上调。通过综合整合表型比较（例如，高产菌株31.1在酵母增殖和乙醇发酵中的发酵性能）、比较基因组学、转录组学以及涉及氧化磷酸化和细胞周期（与酵母细胞生长相关）途径的生物信息学分析，研究人员在树干毕赤酵母中鉴定出60个与木糖-乙醇高产相关的候选关键基因。这些基因主要参与细胞周期途径，包括CDC15和PHO81。总之，本研究初步揭示了高产菌株在基因组和转录组水平上高木糖乙醇生产的机制。
**论文解读：60Co诱变树干毕赤酵母高木糖-乙醇发酵的基因组与转录组机制**
**1. 研究背景与问题**
木质纤维素生物质是生产第二代生物乙醇的重要可再生原料，其中甘蔗渣含有丰富的纤维素和半纤维素，水解后生成葡萄糖和木糖。然而，野生型酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）无法利用木糖进行乙醇发酵，这成为纤维乙醇规模化生产的主要瓶颈。树干毕赤酵母（Scheffersomyces stipitis，原名Pichia stipitis）天然具有发酵木糖产乙醇的能力，被认为是当前最理想的木糖发酵微生物之一。但其野生型菌株的乙醇产量和生产率仍不能满足工业需求。传统诱变育种（如60Co γ射线诱变）可有效改善菌株性能，但以往研究多集中于表型筛选，缺乏从基因组和转录组水平系统解析高产机制的报道。因此，本研究旨在通过60Co诱变结合长期驯化，获得高产菌株，并利用比较基因组学和转录组学揭示其高产分子机制，鉴定关键候选基因，为后续代谢工程改造提供理论依据。该论文发表在《Life》。
**2. 主要技术方法（不超过250字）**
本研究采用以下关键技术方法：① **60Co γ射线诱变**：对树干毕赤酵母野生型菌株CICC 1960（购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC）进行9个剂量（0.4–2.0 kGy）的辐照处理，筛选获得高产菌株31.1和低产菌株12.1；② **长期驯化**：将诱变后的菌株在甘蔗糖蜜中驯化3个月以上，进一步提升木糖-乙醇发酵性能；③ **全基因组测序（WGS）**：对三株菌（野生型1960、高产31.1、低产12.1）进行Illumina双端150 bp测序，进行基因组组装、结构变异（SV）分析、基因功能注释（GO、KEGG、CAZy等）；④ **转录组测序（RNA-Seq）**：在发酵早期（12 h）和乙醇含量最高时（60 h）取样，进行链特异性文库构建和Illumina测序，识别差异表达基因（DEGs），并进行富集分析；⑤ **qPCR验证**：随机选取约20个DEGs进行实时荧光定量PCR验证，确认RNA-Seq数据的可靠性；⑥ **生物信息学整合分析**：结合表型比较，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）和蛋白质相互作用（PPI）等，筛选候选关键基因。
**3. 研究结果**
**3.1 诱变育种研究**
通过对野生型菌株1960进行60Co诱变，低剂量（0.4–1 kGy）产生更多正突变菌株，其中1 kGy剂量下获得的菌株1K-9表现最优。将1K-9等菌株在甘蔗糖蜜中驯化后，筛选出高产菌株31.1。以15%（w/v）木糖发酵60 h，菌株31.1的乙醇产量比野生型提高14.13%（p<0.001），低产菌株12.1则降低25.61%。生长曲线显示，突变株生长速率均慢于野生型，但差异不显著。发酵曲线表明，高产菌株31.1的木糖-乙醇生产率为0.78 g/(L·h)，糖-乙醇转化率为0.38 g/g，发酵效率为82.61%，均优于野生型（0.66 g/(L·h)、0.33 g/g、71.74%）和低产菌株（0.43 g/(L·h)、0.29 g/g、63.04%）。木糖利用率方面，高产菌株达98.52%，高于野生型（97.81%）和低产菌株（86.83%）。
**3.2 与其他菌株的发酵性能比较**
与文献报道的菌株（如Paecilomyces sp. NF1、S. stipitis CBS 5576、Spathaspora passalidarum等）相比，菌株31.1的乙醇生产率（0.78 g/(L·h)）处于国内同类研究先进水平，发酵效率（82.61%）与近期报道的S. stipitis UFMG-CM-Y2303等相当，但生产率更高。
**3.3 高产关键基因挖掘**
**3.3.1 比较基因组学研究**
对三株菌进行基因组测序和组装，获得高质量数据（Q30>92%，比对率>93%）。基因预测显示，高产菌株31.1的预测基因数（705）略高于野生型（676），且在不同数据库（如CAZy）中注释基因更多，特别是糖基转移酶基因（81个，野生型78个）。基因组结构变异（SV）分析发现，高产菌株与野生型之间共有271个结构变异，与低产菌株之间有223个结构变异，表明基因组结构存在差异。
**3.3.2 比较转录组学研究**
在发酵早期（12 h）和乙醇高峰期（60 h）进行转录组分析。差异表达基因（DEG）统计显示：在12 h时，低产菌株vs野生型组DEG最多（2303个）；在60 h时，高产菌株vs野生型组DEG最多（1385个）。关键发现：① 在12 h，高产菌株vs低产菌株中，木糖代谢关键基因XYL1（木糖还原酶）、XYL2（木糖醇脱氢酶）、XKS1（木酮糖激酶）均上调；② 在60 h，高产菌株vs野生型中，XYL1和XUT4（高亲和力木糖转运蛋白）显著上调；③ 高产菌株自身60 h vs 12 h的DEG数量最多（2453个），且XYL1、XKS1、XUT4、PDC1、PDC2、ARO10等关键基因均上调。KEGG富集分析表明，高产菌株与野生型在60 h时显著富集于氧化磷酸化途径，其中46个DEG中45个下调，仅NBM8（NADH-泛醌氧化还原酶B18亚基）上调，提示代谢从呼吸转向发酵。qPCR验证了随机选取的基因，结果与RNA-Seq一致，验证率为100%。
**3.3.3 候选关键基因鉴定**
综合表型比较、比较基因组、转录组及生物信息学分析，在树干毕赤酵母中鉴定出60个候选关键基因，其中18个主要参与细胞周期途径（如CDC15、PHO81），42个与氧化磷酸化相关。这些基因直接来源于本次转录组数据，为后续功能验证提供了靶点。
**4. 讨论与结论**
**讨论部分**总结：本研究通过60Co诱变获得高产菌株31.1和低产菌株12.1，其发酵性能差异显著。诱变产生的正突变和负突变可能与XYL1、XYL2、XKS1等关键基因的碱基变化有关，但需进一步通过代谢物分析（如木糖醇）验证。与文献报道的菌株相比，31.1的乙醇生产率（0.78 g/(L·h)）具优势。基因组和转录组优势表现为：高产菌株基因注释数更多，尤其糖基转移酶基因增加，可能增强细胞壁完整性和胁迫耐受性；氧化磷酸化途径广泛下调，促进碳流转向乙醇发酵；两关键基因XYL1和XUT4上调。此外，巯基氨基酸代谢（如甲硫氨酸）差异也可能影响发酵性能。
**结论部分翻译**：本研究成功通过60Co诱变结合长期甘蔗糖蜜驯化，开发了高乙醇产率的树干毕赤酵母菌株31.1。该菌株的乙醇生产率为0.78 g/(L·h)，木糖-乙醇转化率为0.38 g/g，发酵效率为82.61%，较野生型有显著提升。比较基因组学揭示了271个结构变异和糖基转移酶基因增加，转录组学显示氧化磷酸化基因下调及关键木糖代谢基因（XYL1、XUT4）上调。这些发现表明，高产表型源于代谢从呼吸向发酵的转变，以及增强的细胞壁完整性和胁迫耐受性。重要的是，本研究为理解树干毕赤酵母木糖发酵的遗传基础提供了多组学资源，并鉴定了60个候选基因（如CDC15、PHO81及氧化磷酸化组分），可用于未来代谢工程优先改造。本研究证明，传统诱变结合比较基因组学和转录组学，仍是菌株改良和机制发现的有力手段，为开发能将木质纤维素糖转化为生物燃料的工业酵母提供了蓝图。主要创新点：筛选获得菌株31.1，其木糖-乙醇生产率、糖-乙醇转化率和发酵效率分别为0.78 g/(L·h)、0.38 g/g和82.61%，为酵母转化甘蔗渣产乙醇奠定了基础。展望：未来需利用基因敲除和过表达技术（如BLINCAR）验证候选基因功能，并结合系统与合成生物学策略进一步优化菌株。
