《Horticulturae》：Genome-Wide Identification and Characterization of WOX Genes Regulating Somatic Embryogenesis in Catalpa bungei
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体细胞胚发生（Somatic embryogenesis, SE）是植物再生、微繁殖和遗传改良不可或缺的生物技术平台。WUSCHEL-related homeobox（WOX）转录因子家族成员是SE中的关键调控因子，然而它们在楸树（Catalpa bungei
体细胞胚发生（Somatic embryogenesis, SE）是植物再生、微繁殖和遗传改良不可或缺的生物技术平台。WUSCHEL-related homeobox（WOX）转录因子家族成员是SE中的关键调控因子，然而它们在楸树（Catalpa bungei）中的作用尚未被充分探索。楸树是中国特有的高品质观赏树种，具有显著的园艺观赏价值。在此，研究人员首次在楸树中进行了全基因组鉴定和SE过程中CbWOX基因家族的表达谱分析。共鉴定出14个CbWOX基因，并系统发育分类为三个主要分支。这些基因分布于楸树的11条染色体上，其启动子区域富集了与植物激素响应、胁迫适应和生长/发育相关的顺式调控元件。整合转录组和实时定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）数据表明，CbWOX2、CbWOX5、CbWOX8和CbWOX9在胚性愈伤组织（embryogenic callus, EC）中高表达，而CbWOX1.1和CbWOX13主要在非胚性愈伤组织（non-embryogenic callus, NEC）中表达。值得注意的是，在14个CbWOX基因中，仅8个在SE过程中显著表达，并在不同发育阶段呈现独特的表达谱。CbWOX4.1和CbWOX4.2特异性地与黄绿色下胚轴愈伤组织的发育相关，而CbWOX2和CbWOX8在EC阶段高表达。在SE后期阶段，CbWOX1.2、CbWUS、CbWOX5和CbWOX13在球形胚（globular embryo, GE）阶段显著表达，而CbWOX1.3在子叶胚（cotyledon embryo, CE）阶段特异性上调。该研究为楸树CbWOX家族提供了全面的基因组和转录组基础，并揭示了在SE过程中具有阶段特异性表达的候选基因。这些发现为后续功能研究奠定了坚实基础，以提升SE效率并推进这一珍贵观赏树的大规模繁殖。
论文解读：楸树WOX基因家族的全基因组鉴定及其在体细胞胚发生中的调控作用
一、研究背景与目的
体细胞胚发生（Somatic embryogenesis, SE）是植物离体再生、微繁殖和遗传转化的核心技术平台，具有高效克隆和基因工程应用潜力。然而，楸树（Catalpa bungei）作为一种原产于中国的高品质观赏树种，其在SE过程中面临诸多挑战，包括基因型依赖性高、成熟种子诱导效率低（仅35.29%–59.82%）、长期继代培养中易褐变及再生能力下降等问题。这些限制因素严重阻碍了楸树的高效遗传转化和基因编辑技术的应用。WUSCHEL-related homeobox（WOX）转录因子家族是调控细胞命运转变和胚胎发育的关键因子，在模式植物中已被证实参与SE的多个阶段，如在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea mays）中调控干细胞维持、胚胎模式建成和胚性愈伤组织诱导。然而，WOX基因在楸树中的具体功能尚未被系统研究。因此，本研究旨在通过全基因组水平鉴定和表达谱分析，揭示CbWOX基因家族在楸树SE过程中的潜在作用，为提升SE效率提供分子靶标和理论基础。
二、研究方法概述
研究人员利用楸树全基因组数据，结合HMMER搜索和NCBI BLASTp验证，系统鉴定了CbWOX基因家族成员。通过系统发育分析（基于最大似然法）、保守基序预测（MEME工具）、基因结构分析（内含子/外显子排列）以及启动子区顺式调控元件预测（PlantCARE数据库），全面解析了该家族的特征。此外，采用转录组测序（RNA-seq）和定量实时PCR（qPCR）技术，分析了不同愈伤组织类型（包括黄愈伤组织YC、软绿愈伤组织SGC、致密绿愈伤组织CGC、褐愈伤组织BC和非胚性愈伤组织NEC）以及SE各阶段（未成熟胚EMB、黄绿色下胚轴愈伤组织YG-HC、胚性愈伤组织EC、球形胚GE、子叶胚CE）中CbWOX基因的表达动态。样本来源于楸树基因型12-13的未成熟种子诱导的愈伤组织，并设置三个生物学重复。
三、主要研究结果
（一）全基因组鉴定与理化性质分析
研究共鉴定出14个CbWOX基因，编码蛋白长度范围为151至368个氨基酸，分子量介于17,076.31至40,551.36 Da之间。多数CbWOX蛋白（13/14）预测为不稳定蛋白，且所有蛋白均为亲水性。其中，CbWUS作为关键干细胞调控因子，编码256个氨基酸的蛋白，其理化特征与其他成员存在差异。
（二）系统发育分析
基于与毛果杨（Populus trichocarpa）、水稻、玉米和拟南芥的WOX蛋白序列构建的系统发育树显示，CbWOX家族分为三个进化分支：现代分支（WUS/modern）包含9个成员（CbWOX1.1、CbWOX1.2、CbWOX1.3、CbWOX2、CbWOX3、CbWOX4.1、CbWOX4.2、CbWOX5和CbWUS），中间分支包含3个成员（CbWOX8、CbWOX9和CbWOX12），古老分支包含2个成员（CbWOX13和CbWOX10）。现代分支成员最多，古老分支最少。
（三）保守基序与基因结构分析
保守基序分析发现6个保守基序，其中基序1和2存在于几乎所有CbWOX蛋白中（除CbWOX10外），基序4为现代分支特有，基序6为中间分支特有。基因结构显示，外显子数量介于2至6个之间，现代分支中的CbWOX1.1、CbWOX1.2和CbWOX1.3具有最多的外显子（3个），表明其可能通过基因扩展获得新功能。
（四）启动子顺式调控元件分析
对2000 bp启动子区分析共鉴定出217个顺式调控元件，分为三类：植物激素响应元件（包括赤霉素GA、脱落酸ABA、生长素、水杨酸SA和茉莉酸甲酯MeJA响应元件）、胁迫响应元件（低温、厌氧、干旱和防御响应）以及生长发育调控元件（分生组织表达、昼夜节律、种子特异、胚乳表达和蛋白结合位点）。其中，CbWOX2含种子特异调控元件，CbWOX5和CbWUS含胚乳表达元件，所有CbWOX基因均含光响应元件。
（五）染色体定位与共线性分析
CbWOX基因分布于楸树的11条染色体上，其中3、7和8号染色体各含2个基因，其余染色体各含1个。共线性分析发现一个串联重复事件（CbWOX9和CbWOX10在8号染色体上）和三个片段重复事件（涉及CbWOX8/CbWOX10、CbWOX4.1/CbWOX4.2和CbWOX1.1/CbWOX1.2）。种间共线性分析显示，楸树与毛果杨的WOX基因共线性程度高于与拟南芥，表明两者亲缘关系更近。
（六）转录组表达谱分析
RNA-seq分析（EC与NEC比较）鉴定出7个显著差异表达的CbWOX基因，其中5个在EC中上调（CbWOX2、CbWOX8、CbWOX9、CbWOX10和CbWOX12），2个在NEC中上调（CbWOX1.1和CbWOX13）。聚类热图显示CbWOX9和CbWOX10表达模式最相似，而CbWOX4.1和CbWOX4.2在NEC中表达相对较高。
（七）不同愈伤组织类型中的表达分析
qPCR分析显示，9个CbWOX基因（CbWUS、CbWOX1.2、CbWOX1.3、CbWOX2、CbWOX5、CbWOX8、CbWOX9、CbWOX10和CbWOX12）在EC中显著上调。其中，CbWOX2、CbWOX5、CbWOX8和CbWOX9构成第一组，在EC中表达水平极高，如CbWOX9在EC中的表达量比SGC高6823.85倍。第二组（CbWUS、CbWOX1.2、CbWOX1.3、CbWOX10和CbWOX12）在EC中也有上调，但幅度较小。CbWOX13在CGC中表达最高，CbWOX1.1在SGC中优势表达。
（八）SE不同阶段的表达动态分析
在SE过程中，仅8个CbWOX基因显著表达。CbWOX4.1和CbWOX4.2与YG-HC发育相关；CbWOX2在EC阶段高表达（相对表达量6.96）；CbWOX1.2、CbWUS、CbWOX5和CbWOX13在GE阶段显著表达，其中CbWOX1.2表达最高（71.09）；CbWOX1.3在CE阶段特异性上调（2.82）。此外，CbWOX3主要在EMB阶段表达并呈下降趋势，CbWOX8在EMB、EC和GE阶段均高表达，CbWOX9和CbWOX12在EMB后仍保持表达，CbWOX10在EMB和后期阶段（GE或CE）有表达。
四、讨论与结论
讨论部分指出，CbWOX基因家族的大小与二倍体植物相当，但少于多倍体物种。系统发育和基因结构分析表明，基因重复（串联和片段重复）驱动了功能多样化。启动子分析揭示CbWOX基因参与激素和胁迫响应，如CbWOX9的启动子富含激素响应元件，可能介导其在EC中的强烈激活。在表达动态方面，CbWOX2、CbWOX8和CbWOX9的上调与EC诱导密切相关，与咖啡、葡萄等物种中的WOX2/8/9同源基因功能一致，表明它们可能是SE早期标记基因。相反，CbWOX13可能负调控胚性转化，维持细胞未分化状态。在SE后期，CbWUS、CbWOX5和CbWOX1.2在GE阶段的共表达可能参与胚胎模式建成和维管原基形成，而CbWOX1.3在CE阶段的上调暗示其调控子叶发育。讨论提出，通过基因操作（如过表达CbWOX2/8/9或抑制CbWOX13）可能提高楸树SE效率，并建议未来利用CRISPR/Cas9和蛋白-DNA互作分析（如ChIP-qPCR、EMSA、Y1H）验证功能。
结论部分翻译：本研究首次全面表征了楸树WOX转录因子家族，鉴定出14个CbWOX基因，系统发育分为古老、中间和现代分支，其中WUS分支最丰富。8号染色体上的CbWOX9和CbWOX10串联重复以及分支特异性保守基序支持基因重复驱动的功能多样化。比较转录组分析显示CbWOX2、CbWOX8和CbWOX9在EC中显著上调，而CbWOX1.1和CbWOX13在NEC中优先表达，表明它们在愈伤组织身份调控中具有不同作用。整合表达谱进一步揭示了SE过程中的阶段特异性调控功能：EC诱导期间，CbWOX4.1/4.2与早期愈伤组织形成相关，CbWOX2/8作为早期EC标记；在后期胚胎阶段，CbWOX9、CbWUS、CbWOX1.2、CbWOX5和CbWOX13在球形胚发育中达到峰值，可能参与胚胎模式形成和维管原基特化，而CbWOX1.3在子叶胚中特异性上调，提示其在子叶发育中的作用。这些结果为理解楸树SE的转录动态奠定了基础，但未来仍需通过遗传验证、蛋白-DNA互作分析和高分辨率时空表达研究来完全阐明CbWOX基因的机制性作用。该研究发表在《Horticulturae》。
