《Current Issues in Molecular Biology》：The Characterization of a New AG-II-like Glycoprotein from Cynanchum thesioides (Freyn) K. Schum and Its Immunostimulatory Activity Through Activation of TLR4/9-Mediated MAPK/NF-κB Signaling Pathways
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来自食用药用植物的阿拉伯半乳聚糖蛋白（arabinogalactan proteins，AGPs）的结构和免疫调节特性在很大程度上仍未被探索。本研究通过热水提取、乙醇沉淀和柱层析法，从地梢瓜（Cynanchum thesioides）中分离得到一种均质的AG-
来自食用药用植物的阿拉伯半乳聚糖蛋白（arabinogalactan proteins，AGPs）的结构和免疫调节特性在很大程度上仍未被探索。本研究通过热水提取、乙醇沉淀和柱层析法，从地梢瓜（Cynanchum thesioides）中分离得到一种均质的AG-II样阿拉伯半乳聚糖蛋白（CTSP-W2，9862 Da）。研究人员采用高效凝胶渗透色谱（high-performance gel permeation chromatography，HPGPC）、傅里叶变换红外光谱（Fourier-transform infrared spectroscopy，FT-IR）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、刚果红染色、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和甲基化分析对其结构进行了全面表征。研究人员使用特异性抑制剂、蛋白质印迹法（Western blotting）和分子对接技术研究了其免疫活性的机制。CTSP-W2由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、木糖和18种氨基酸（富含天冬酰胺）组成，其主链为→3,6)-Galp-(1→和→6)-Galp-(1→。CTSP-W2显著增强了巨噬细胞的增殖、吞噬作用以及一氧化氮（Nitric oxide，NO）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）的分泌。抑制剂实验表明，Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4，TAK-242）和Toll样受体9（Toll-like receptor 9，TLR9，E6446）拮抗剂以剂量依赖性方式显著降低了CTSP-W2诱导的TNF-α、IL-6和NO的产生，而Toll样受体2（Toll-like receptor 2，TLR2）抑制（C29）则意外上调了这些介质。Western blot结果显示，CTSP-W2上调了TLR4和TLR9蛋白的表达，并增加了核因子κB抑制蛋白α（Inhibitor of nuclear factor kappa-B alpha，IκBα）、核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB p65）和p38的磷酸化，表明TLR4/9–NF-κB–p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号轴被激活。此外，分子对接分析进一步表明，CTSP-W2通过其半乳糖链与TLR4形成极强的氢键和疏水相互作用。本研究阐明了CTSP-W2的免疫调节机制，并为阿拉伯半乳聚糖蛋白作为潜在天然免疫调节剂奠定了分子基础。
**《地梢瓜新型AG-II样糖蛋白CTSP-W2的免疫调节机制研究》论文解读**
**1. 研究背景与目的**
植物来源的糖蛋白作为一类重要的生物大分子，因其多样的结构和显著的生物活性，如免疫调节、抗肿瘤、抗氧化和抗炎等，日益受到关注。阿拉伯半乳聚糖蛋白（arabinogalactan proteins，AGPs）是植物细胞壁中广泛存在的一类高度糖基化的糖蛋白，属于II型阿拉伯半乳聚糖（type II arabinogalactans，AGs），其典型特征是以β-(1→3)-和β-(1→6)-连接的D-半乳糖基为主链，并带有复杂的侧链。已有研究表明，多种植物来源的阿拉伯半乳聚糖，如来源于苦荬菜、茉莉花加工废料、薜荔果壳及没药属植物的多糖，均能通过Toll样受体4（TLR4）/Toll样受体2（TLR2）介导的NF-κB和MAPK通路激活RAW264.7巨噬细胞，促进吞噬作用及NO、TNF-α、IL-6等炎症因子的释放。然而，关于这些多糖精确的构效关系（structure-activity relationship，SAR）仍不明确，且多数报道的阿拉伯半乳聚糖来源植物科属有限，许多潜在的药用植物资源尚未被充分挖掘。
地梢瓜（*Cynanchum thesioides* (Freyn) K. Schum）是萝藦科鹅绒藤属的一种药用植物，其果实可食用，全草入药，在中医和蒙医中传统上用于补气养阴、治疗产后虚弱等。该植物富含多糖、蛋白质等营养成分，被视为开发功能性食品的优质原料。尽管已有研究报道了同属植物如隔山消（*C. wilfordii*）、牛皮消（*C. auriculatum*）和白薇（*C. atratum*）的多糖具有免疫调节活性，但地梢瓜中阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）的结构特征和免疫调节机制尚未被探索。鉴于TLR4和TLR9在识别病原体相关分子模式中的关键作用，以及它们激活下游NF-κB和MAPK信号通路的能力，本研究旨在从地梢瓜中分离纯化出一种均一的糖蛋白，系统表征其结构、形态，并评估其在体外对巨噬细胞的免疫调节作用及分子机制，为地梢瓜在功能性食品和药品中的开发利用提供理论依据。
**2. 关键技术方法**
研究人员采用了多种关键技术方法。首先，通过热水提取、乙醇沉淀和Sevag法脱蛋白获得粗糖蛋白（CTSP），再依次采用DEAE-纤维素52阴离子交换层析和Sephadex G-100凝胶柱层析进行纯化，得到均一组分CTSP-W2。其次，运用高效凝胶渗透色谱（HPGPC）测定分子量，离子色谱（IC）分析单糖和氨基酸组成，SDS-PAGE结合考马斯亮蓝和PAS染色验证其糖蛋白性质。结构表征方面，综合运用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、甲基化分析结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）、一维和二维核磁共振（NMR）波谱、扫描电子显微镜（SEM）、β-消除反应、圆二色谱（CD）和刚果红实验等技术。在活性机制研究上，采用CCK-8法、中性红摄取实验评估细胞活力和吞噬活性，ELISA和Griess法检测细胞因子和NO分泌，并利用特异性受体抑制剂（TAK-242、E6446、C29）、Western blot检测信号通路蛋白磷酸化水平，最后通过HDOCK分子对接模拟分析配体-受体相互作用。样本来源为2024年夏季采集于中国内蒙古赤峰市的地梢瓜全草。细胞实验使用小鼠巨噬细胞系RAW 264.7。
**3. 研究结果**
**3.1 CTSP-W2的分离、纯化与理化性质**：通过热水提取和酒精沉淀获得粗糖蛋白CTSP，得率为10.28%。经DEAE-52层析得到四个组分，其中主要组分CTSP-W经Sephadex G-100进一步纯化，得到均一组分CTSP-W2，HPGPC显示其呈单一对称峰，平均分子量为9.862 × 103 Da。化学组成分析表明，CTSP-W2总糖含量和蛋白含量分别为33.16%和12.30%，由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和木糖组成，摩尔比为0.498:0.274:0.086:0.053:0.052:0.037。氨基酸分析显示其含有18种氨基酸，其中天冬酰胺含量最高。SDS-PAGE和PAS染色证实其为不含游离多糖或蛋白的均一单体型糖蛋白。
**3.2 CTSP-W2的结构表征**：FT-IR光谱显示了多糖和蛋白的特征吸收峰。甲基化分析结合GC-MS共鉴定出16种糖残基，其中半乳糖残基包含→3,6)-Galp-(1→、→6)-Galp-(1→等7种连接方式，阿拉伯糖残基包含→5)-Araf-(1→等3种连接方式。β-消除反应证实CTSP-W2中存在O-糖苷键。CD光谱显示其具有丰富的二硫键网络和以无序结构为主的稳定构象。刚果红实验表明CTSP-W2具有三股螺旋空间构象。SEM观察显示其具有多孔的三维网络结构。NMR分析（1D和2D）进一步确认了其结构特征，提出其主链由→6)-Galp-(1→和→3,6)-Galp-(1→构成，并在C3位分支连接至→5)-Araf-(1→、→3,5)-Araf-(1→、→4)-Manp-(1→等残基，符合II型阿拉伯半乳聚糖的结构特点。
**3.3 CTSP-W2对RAW 264.7巨噬细胞的免疫调节活性**：CCK-8实验结果显示，CTSP-W2在25-400 μg/mL浓度范围内能浓度依赖性地显著促进RAW 264.7细胞增殖，且在50-200 μg/mL浓度下促进作用强于LPS阳性对照组。中性红摄取实验表明，CTSP-W2能显著增强巨噬细胞的吞噬能力。ELISA和Griess实验结果显示，CTSP-W2处理能显著促进巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6和NO。
**3.4 CTSP-W2的免疫调节机制**：利用TLR4、TLR9和TLR2的特异性抑制剂（TAK-242、E6446和C29）预处理细胞后发现，TAK-242和E6446能剂量依赖性地显著抑制CTSP-W2诱导的TNF-α、IL-6和NO分泌，而TLR2抑制剂C29则意外上调了这些介质的表达。Western blot结果显示，CTSP-W2处理能显著上调TLR4和TLR9蛋白的表达，并增加p-IκBα、p-NF-κB p65和p-p38的磷酸化水平，表明其通过激活TLR4/9介导的NF-κB和p38 MAPK信号通路发挥作用。分子对接分析进一步证实，CTSP-W2的糖链能与TLR4/MD-2复合物形成稳定的氢键和疏水相互作用，预测结合分数远优于其与TLR2的结合，与抑制剂实验结果一致。
**4. 讨论与结论**
本研究首次系统研究了从地梢瓜中分离的均质阿拉伯半乳聚糖蛋白CTSP-W2的结构和免疫调节机制。CTSP-W2具有典型的II型阿拉伯半乳聚糖结构特征，即β-(1→6)-连接的半乳聚糖主链，其高半乳糖含量可能与其强免疫调节活性密切相关。研究证实CTSP-W2主要通过TLR4/9而非TLR2受体激活巨噬细胞，进而触发下游NF-κB和MAPK信号通路，促进炎症因子的分泌。分子对接结果从原子层面支持了CTSP-W2与TLR4的高亲和力结合。本研究阐明了CTSP-W2的免疫调节机制，为将阿拉伯半乳聚糖蛋白开发为天然免疫调节剂奠定了分子基础。
研究结论明确指出，CTSP-W2作为一种新型的阿拉伯半乳聚糖蛋白，能有效增强巨噬细胞的免疫功能，包括增殖、吞噬以及NO、TNF-α和IL-6等炎症介质的分泌。机制研究揭示其通过TLR4/9介导的NF-κB和MAPK信号通路促进巨噬细胞成熟。然而，该研究也存在局限性，即仅通过体外RAW264.7细胞系评估了其活性，尚需体内动物模型研究以全面评估其药代动力学、生物安全性及治疗功效。未来工作将集中在建立小鼠模型评估体内效果、精确解析受体结合表位以及通过结构修饰探索构效关系，以推动CTSP-W2作为安全有效的免疫调节剂的转化开发。
