具有顺序释放Mn2+/Co2+功能的层状核壳纳米平台，可实现双路径STING信号放大与放射增敏效应，从而用于高效的放射性金属免疫疗法

《Acta Biomaterialia》：Hierarchical Core-Shell Nanoplatform with Sequential Mn2+/Co2+ Release Enables Dual-Track STING Amplification and Radiosensitization for Potent Radio-Metalloimmunotherapy

　　摘要：癌症免疫疗法常常受到免疫抑制性肿瘤微环境以及缺氧条件下环GMP-AMP合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）通路激活效率低下的阻碍。为解决这些问题，我们开发了一种分层核壳结构的Au@Co-EGCG/Mn-EGCG（ACM）纳米平台，该平台将放射敏感性提升与双通道STING放大策略相结合。由于其高原子序数金核以及强大的过氧化氢酶样活性，ACM纳米结构能够有效缓解肿瘤缺氧状况，增加X射线能量沉积，从而产生大量活性氧，造成DNA不可修复的损伤。这种协同作用进而引发强烈的免疫原性细胞死亡，并导致大量线粒体DNA泄漏。关键在于，肿瘤细胞内Mn2+和Co2+离子的分层释放形成了“顺序协同级联反应”：Mn2+可增强cGAS对DNA的识别能力，而Co2+则通过提高STING对2′, 3′-环GMP-AMP的结合亲和力，起到高增益放大作用。这一分子级联反应会引发全身性促炎细胞因子的释放，尤其是IFN-β，从而使“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤。在体内实验中，ACM介导的放射治疗不仅能彻底消除肿瘤，还能产生强大的远隔效应，通过增强T细胞浸润和巨噬细胞功能重置来抑制远处转移。总体而言，这项工作为克服放射抵抗和癌症全身性进展提供了一种有效的放射金属免疫疗法新范式。

意义说明：大多数结直肠癌属于微卫星稳定型，由于存在“冷”肿瘤微环境，这类肿瘤对免疫疗法具有抗性。在本研究中，我们设计了一种分层核壳纳米粒子，其在X射线照射下可依次释放两种金属离子，共同激活cGAS-STING通路。与传统单一STING激动剂不同，我们的设计将Mn2+带来的DNA敏感性提升与Co2+驱动的信号放大功能分开，形成了能够克服缺氧诱导的免疫抑制的协同级联反应。这一双通道机制可将抗性的微卫星稳定型肿瘤转化为具有免疫响应性的“热”肿瘤，从而消除原发肿瘤并抑制远处转移。此项研究为放射金属免疫疗法开辟了新路径，为将放射治疗转化为全身性免疫辅助手段提供了可行策略。

引言：近年来，癌症免疫疗法通过利用宿主免疫系统识别并清除恶性细胞，推动了肿瘤学领域的变革[1]。尽管该疗法具有巨大潜力，但仅有少数患者能获得持久临床缓解，主要原因在于抗肿瘤免疫细胞难以渗透到“冷”肿瘤中，且肿瘤微环境中存在复杂的免疫抑制网络。结直肠癌正是这一问题的典型代表：虽然微卫星不稳定性高的亚型对免疫检查点抑制剂反应良好，但超过85%的患者患有微卫星稳定的肿瘤[[2], [3], [4]]。这类肿瘤特征为突变负荷低、T细胞浸润少以及免疫抑制性肿瘤微环境，因此对免疫检查点抑制剂的客观缓解率通常低于5%，这种现象被称为“免疫沙漠”。因此，迫切需要能够逆转免疫抑制、将免疫学上“冷”的肿瘤转化为“热”肿瘤的策略，后者以强烈的T细胞浸润、促炎细胞因子的产生以及对免疫检查点阻滞的反应为特征[5]。在这方面，金属离子近来被证实是调节先天免疫途径的关键因素，为重新编程肿瘤微环境提供了新思路。例如，已有研究表明Mn2+能够增强GMP-AMP合成酶（cGAS）介导的DNA检测功能[6,7]。

在金属离子介导的免疫调节中，cGAS-干扰素基因刺激因子（STING）通路起着核心作用，它是激活先天免疫、重塑肿瘤微环境的关键途径[8]。作为关键的胞质DNA传感器，cGAS能够识别来自损伤相关分子模式的双链DNA，进而催化第二信使2′, 3′-环GMP-AMP的生成[9,10]。cGAMP随后与STING结合并激活其功能，促使I型干扰素及其他促炎细胞因子如TNF-α和IL-6的分泌[[11], [12], [13]]。这一信号级联反应可促进树突状细胞的成熟，帮助将肿瘤抗原呈递给效应T细胞，最终打破肿瘤微环境中的免疫耐受[[14], [15], [16]]。鉴于其在协调先天性和适应性抗肿瘤免疫中的作用，cGAS-STING通路已成为极具前景的治疗靶点。

目前已有几种小分子STING激动剂（如SB11285、MK-1454和ADU-S100）进入临床试验[7,17]。然而，针对肿瘤微环境复杂多变的特性，单一模式激活STING往往效果不足[18]。尤其是实体瘤常见的慢性缺氧现象，不仅会抑制STING本身的表达和功能，还会通过减少胞质DNA含量及削弱cGAS的酶活性，严重限制内源性cGAS-STING通路的激活效率，从而影响该通路的启动和执行两个环节[19]。值得注意的是，结直肠癌肿瘤微环境中普遍存在缺氧现象，这会促进肿瘤逃避免疫监视，进一步加剧微卫星稳定型结直肠癌对免疫疗法的抵抗[20]。因此，即便使用直接的STING激动剂，也往往无法在缺氧肿瘤中引发强烈免疫反应。此外，该通路的有效激活还依赖于充足的胞质双链DNA供应，而在复杂的肿瘤微环境中实现这一条件十分困难。因此，亟需开发一种能够整合多种激活机制、在协同增强STING信号的同时重塑肿瘤微环境的策略，以改善临床治疗效果。在这方面，放射治疗可通过产生胞质双链DNA提供辅助作用，但其治疗效果却因缺氧的肿瘤微环境而大打折扣。

放射治疗作为临床癌症治疗的基石，可通过直接诱导DNA损伤或产生活性氧来杀死恶性细胞[21]。然而，肿瘤内部异常且功能失调的血管结构会导致严重缺氧，这会降低能量沉积量并减少自由基生成，从而显著削弱放射治疗的效果[22]。此外，缺氧的肿瘤细胞还会上调活性氧清除剂（如谷胱甘肽）和DNA修复蛋白的表达，进一步增加对放射治疗的抵抗性[23]。值得一提的是，除直接的细胞毒性作用外，放射治疗还具有调控抗肿瘤免疫的强大能力。放射诱导的抗原释放可引发免疫原性细胞死亡，在少数情况下还能产生“远隔效应”，即针对远处未接受放射治疗的肿瘤产生全身性抗肿瘤反应[24]。但由于肿瘤微环境的免疫抑制作用以及抗原呈递不足，这一现象在临床中极为罕见。从机制上看，放射诱导的DNA损伤以及随后胞质中双链DNA的释放，可为激活cGAS-STING通路提供必要信号[25,26]。尽管具备这种潜力，目前的放射治疗为基础的免疫疗法主要侧重于诱导免疫原性细胞死亡或与免疫检查点抑制剂联合使用[[27], [28], [29], [30]]。遗憾的是，仅依靠放射治疗诱导的免疫原性细胞死亡往往不足以在不改变肿瘤微环境的情况下实现转移性疾病的控制[[31], [32], [33]]。

为应对这些挑战，尤其是缺氧引起的放射抵抗以及单纯放射治疗免疫原性不足的问题，我们设计了一种分层核壳结构的Au@Co-EGCG/Mn-EGCG（ACM）纳米平台，用于提升放射敏感性、调节肿瘤微环境并实现双通道STING通路增强。该ACM纳米结构由金纳米粒子核心、内部的Co-EGCG结构层以及外层的Mn-EGCG层组成。表没食子儿茶素没食子酸酯作为一种仿生设计的金属配位支架，有助于维持这种分层结构。完整的ACM纳米平台具有协同的过氧化氢酶样活性，能够分解体内的过氧化氢，产生氧气，从而缓解肿瘤缺氧状况。当X射线作用于该平台时，会触发一系列协同反应。高原子序数的金核可有效吸收X射线能量，增强DNA损伤并产生大量活性氧，进而引发强烈的免疫原性细胞死亡和大量线粒体DNA泄漏。X射线照射是整个过程的起始因素，它会导致胞质DNA损伤并产生一定水平的cGAMP[34]。在酸性的肿瘤微环境中，外层的Mn2+会首先从ACM的双层壳结构中释放出来，增强cGAS的功能，提高cGAMP的生成量，进而强化初始信号[35]。随后释放的内层Co2+则起到高增益放大作用，通过提高STING对cGAMP的结合亲和力，将强化的信号转化为更强的下游激活效应，进而引发全身性促炎细胞因子的释放，如IFN-β。通过将免疫原性细胞死亡带来的抗原供应与STING介导的促炎激活相结合，ACM介导的放射治疗不仅能彻底消灭原发肿瘤，还能通过全身性免疫激活产生强大的远隔效应。这种“放射敏感性提升–氧合作用–双通道STING通路增强”相结合的策略为放射金属免疫疗法提供了全新的设计思路，有望克服放射抵抗和癌症的全身性进展，为治疗免疫疗法抵抗性的微卫星稳定型结直肠癌带来新的希望。

图1：部分内容

金纳米粒子及核壳结构Au@Co-EGCG（AC）纳米粒子的合成：将1毫升1毫摩尔浓度的四氯金酸四水合物与10微升40毫克/毫升浓度的表没食子儿茶素没食子酸酯在室温下混合，使用涡旋混合器充分搅拌，直至溶液颜色变为红色且保持不变。然后将所得金纳米粒子通过离心（10000转/分钟，10分钟）分离出来，再用清水洗涤以去除多余的表没食子儿茶素没食子酸酯。为了制备Au@Co-EGCG（AC）纳米粒子，再向上述金纳米粒子溶液中加入10微升11毫摩尔浓度的六水合硝酸钴，继续剧烈搅拌30秒。

ACM的结构特征与物理化学性质：为实施所提出的整合放射敏感性提升、缺氧缓解及双通道STING通路增强的放射金属免疫疗法策略，我们设计了一种具有精确工程化结构的分层核壳纳米平台。具体而言，ACM纳米平台是通过逐步组装的方式构建的（见图1A）。首先，利用表没食子儿茶素没食子酸酯还原氯金酸，形成金纳米粒子核心。随后，在金纳米粒子核心上依次沉积内层的Co-EGCG结构和外层的Mn-EGCG结构层。

结论：在本研究中，我们成功构建了一种分层核壳结构的Au@Co-EGCG/Mn-EGCG（ACM）纳米平台，该平台通过将抑制性的肿瘤微环境转化为具有免疫响应性的“热”肿瘤表型，有效解决了治疗免疫学上“冷”肿瘤的难题。ACM平台巧妙地将高原子序数的金核用于发挥物理层面的放射敏感性提升作用，同时利用双金属-多酚复合壳结构提供协同的过氧化氢酶样活性，以缓解肿瘤缺氧状况。最为重要的是，我们认为该平台通过多种机制协同作用，实现了对肿瘤免疫环境的有效调控。

CRediT作者贡献声明：罗百一：概念设计、方法学、研究实施、初稿撰写、论文修订与编辑。项庆明：概念设计、方法学、研究实施、论文修订与编辑。谢英玲：验证工作、研究实施。王硕：方法学、研究实施。徐宇：项目监督、资金筹集、初稿撰写。田健：概念设计、论文修订与编辑、项目管理、资金筹集。

动物实验说明：本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。该研究已获得中国武汉大学动物实验伦理委员会的批准（批准编号：WAEF20250181）。

利益冲突声明：作者们声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

数据可用性声明：相关支持信息可从Wiley在线图书馆或作者处获取。

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CRediT作者贡献声明：罗百一：论文修订与编辑、初稿撰写、方法学、研究实施、概念设计。项庆明：论文修订与编辑、初稿撰写、方法学、研究实施、资金筹集。谢英玲：方法学、研究实施。王硕：验证工作、研究实施。徐宇：论文修订与编辑、初稿撰写、项目监督、资金筹集、概念设计。田健：论文修订与编辑、初稿撰写。罗百一|项庆明|谢英玲|王硕|徐宇|田健