光生物反应器条件下培养盐度对隐球藻几丁质纳米纤维与脂质共同生成的影响

《Algal Research》：Effects of cultivation salinity on chitin nanofiber and lipid co-production of the diatom Cyclotella cryptica under photobioreactor conditions

　　

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  人工海水培养基中主要盐类的比例变化可调控盐度。
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  盐度会影响几丁质纳米纤维的生成量及其形态。
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  硅元素限制会提升几丁质产量；在固定细胞密度下，有超过90%的纤维可被产出。
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  在5克/升的盐度条件下，几丁质的生产效率达到最高，为210毫克/升·天。
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  在5至20克/升的盐度范围内，最终得到的几丁质浓度相近，约为1094±69毫克/升。

引言

硅藻是光合微生物，属于微藻类，其特点是具有以二氧化硅为成分的细胞壁，即壳状结构。它们不仅能实现较高的生物量产出，还能合成具有商业价值的代谢物，比如脂类、岩藻黄质以及欧米伽-3脂肪酸。因此，许多研究致力于了解影响这些代谢物生成的工艺条件，并探索实现工业化大规模生产的策略。近期的一项重要成果便是将硅藻提取的岩藻黄质实现商业化[1]。

在代谢物生物合成方面，Cyclotella和Thalassiosira物种的独特之处在于它们能够生成N-乙酰葡萄糖胺聚合物几丁质的纳米纤维，并通过壳状结构边缘的特殊开口——即fultoportulae将这些纳米纤维排出体外（见图1）。目前尚未完全弄清这些纳米纤维排出的机制[2]。最被广泛接受的假设是，位于fultoportulae下方的质膜结合型几丁质合成酶会催化单体前体的聚合，同时将形成的长链几丁质排出细胞外[3]。

总体而言，硅藻尤其是Cyclotella物种，还因能在与几丁质生产相关的压力条件下积累脂类和脂肪酸而闻名，比如硅元素限制的情况[4]、[5]、[6]。例如，美国水生生物项目就将C. cryptica视为大规模生产脂类的优质候选物种[6]、[7]。此外，在对175种海洋菌株的筛选中，C. cryptica CCAP 1070/2被认定为生物量含量最高的二十碳五烯酸（EPA）生产菌株，其EPA体积产量也位居第二[8]。

几丁质及其衍生物被广泛应用于多个领域，2023年的市场总价值已超过80亿美元[9]、[10]。工业上使用的几丁质大多来自甲壳类动物的废弃物[11]、[12]。在甲壳类动物体内，几丁质嵌藏在蛋白质与矿物质的复合结构中，这不仅增加了生产难度，还会带来更高的环境负担。作为原料的甲壳类物质需要经过脱蛋白、脱矿质以及纯化等步骤，而这些步骤往往需要在高温且酸性或碱性极强的环境下进行[13]。从应用角度来看，残留的蛋白质以及聚合物物理化学性质的差异，都会限制最终产品的使用效果，尤其是那些对产品质量要求较高的领域[14]。

硅藻则为解决这些问题提供了理想的替代来源：它们可以在完全可控的条件下高速培养，能够提供纯度较高、聚合物性质稳定的几丁质。事实上，硅藻几丁质早已被用作生物医学产品中的止血剂[15]。但目前限制其更广泛应用的主要问题是，基于硅藻的几丁质生产方式难以实现高体积产量和较高的最终产品浓度，从而导致成本高昂，这一点已通过技术经济分析得到证实[16]。

几丁质在硅藻体内的具体生理功能尚不明确。目前最被普遍接受的解释是，排出的几丁质纤维能够提升细胞的浮力，从而抵消因其沉重的二氧化硅壳状结构而带来的沉淀趋势[17]、[18]、[19]。通过降低细胞沉淀速度，这一机制有助于细胞始终停留在海洋环境的光合作用区域。有研究显示，当用几丁质合成抑制剂处理Cyclotella和Thalassiosira细胞后，它们的沉淀速度会加快，这一现象也为该假说提供了支持[17]、[18]、[19]。另一种解释认为，在硅元素不足导致细胞分裂停止的生长状态下，细胞外几丁质的排出是一种释放多余光合作用产物的途径[2]。鉴于目前对几丁质在硅藻体内生理功能的了解仍然有限，有必要系统研究不同培养参数对其生物合成调控及功能意义的影响。

先前的研究已经表明，几丁质的产量在很大程度上取决于工艺条件，尤其是营养物质的供应情况，同时也与菌株的特异性特征有关。尤其是硅元素限制能够提升几丁质产量——例如，在硅元素受限的条件下，细胞内的几丁质含量可从2%上升至10%，而每个细胞产生的纤维数量可从约200根增加到1200根[20]。相反，氮元素或磷元素的缺乏则会抑制几丁质的生产，一旦这两种营养物质耗尽，几丁质的生物合成就会完全停止[3]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。对Cyclotella菌株的筛选显示，不同菌株的几丁质产量存在差异，其中C. cryptica CCMP 333是产量最高的菌株[20]。

盐度是一个重要的工艺参数，在工业微藻生产中被广泛研究并加以利用，因为它会对细胞的代谢过程以及产物形成产生显著影响[27]、[28]。盐度既通过渗透作用，也通过离子特异性机制影响微藻的生理状态[29]、[30]。渗透作用受总溶解盐浓度的控制，会影响细胞的含水量以及维持渗透平衡所需的代谢能量[31]。而离子效应则源于各种离子与细胞内各种机制的相互作用，包括对膜运输过程以及酶功能的影响[32]。例如，在硅藻中，钠离子梯度有助于硅元素跨细胞膜的运输，而硫酸根离子则会抑制钼元素的吸收，而钼元素是参与氮代谢的酶的必需辅因子[33]、[34]。与蛋白质和碳水化合物相比，脂类对盐度变化的敏感度最高[28]、[35]。

在硅藻中，盐度对于决定整体生物量产量、调控细胞内各种产物的碳分配，以及影响与几丁质生物合成相关的生理和形态特征都起着至关重要的作用[28]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]、[41]、[42]、[43]。不过，目前还缺乏针对培养盐度变化对几丁质产量影响的定量研究。通过对硅藻的转录组学和形态学分析，已经有一些证据表明两者之间存在关联[36]、[37]、[39]、[40]、[41]、[42]。例如，Downey等人通过研究Cyclotella cryptica CCMP 332在急性低渗胁迫下的基因反应，发现几丁质生物合成是对培养盐度变化的重要适应性响应[36]。与此同时，当在逐渐增加盐度的条件下培养Skeletonema subsalsum时，与几丁质代谢相关的基因表达会下降[37]。对Thalassiosira和Cyclotella物种的形态学分析也表明，培养基的盐度会影响fultoportulae的数量以及每个细胞内的硅元素含量[36]、[37]、[39]、[40]、[41]、[42]。通常情况下，盐度较低时，硅藻的壳状结构会含有更多的二氧化硅，这一现象被认为是一种补偿机制，旨在提升几丁质合成效率，以应对因盐度降低而增强的细胞沉淀趋势[39]、[40]、[41]、[42]。

以往的研究总体上表明盐度在几丁质生产过程中起着调控作用；不过，尤其是在已知能提升生产力的营养限制条件下，目前还缺乏直接的表型测量数据。本研究的核心目标是了解盐度对几丁质纳米纤维生产的影响，进而基于这一认识制定出提升生产效率的培养策略。为此，研究人员在标准工艺条件下，将一种高产几丁质的菌株在多种不同的盐度水平下进行培养，同时量化了所获得的几丁质纳米纤维的产量以及具有工业应用价值的纤维形态特征。此外，研究还探讨了脂类和脂肪酸的同步生产情况，以评估与生物精炼应用相关的盐度依赖性代谢分配规律。

章节摘要

细胞培养

由于在Cyclotella属物种中具有较高的几丁质产量，Cyclotella cryptica CCMP 333被选为本研究的培养菌株[20]。光生物反应器实验是从该菌株的瓶养培养物开始的，培养过程中保持了相同的盐度水平[44]。培养在25摄氏度下进行，光照强度为70微摩尔/平方米·秒，光照时间为14小时，黑暗时间为10小时。每天会手动搅拌培养瓶10秒。

为调节盐度而对Harrison人工海水培养基进行的改良

本研究使用了Harrison人工海水培养基，之后又进行了若干

细胞生长与营养物质消耗

在培养开始后的150小时内，培养物就消耗了初始存在的全部硅元素（1.8毫摩尔/升），此后细胞密度开始趋于稳定（见图2）。一旦达到稳定状态，细胞密度就会保持不变，但在5克/升和50克/升的盐度条件下，培养后期细胞密度会出现下降。即使细胞密度已经进入稳定期，硝酸盐仍会被持续消耗。培养物的最大量子产率（F_v/F_m）则从最初的

结论

本研究通过在不同盐度条件下培养高产几丁质的硅藻Cyclotella cryptica CCMP 333，探讨了盐度对该菌株生产几丁质纳米纤维以及同步生产脂类的影响，所研究的盐度范围为5至50克/升。为模拟海水环境，研究者通过按比例调整人工海水中三种主要盐类的含量（这三种盐类占人工海水中总盐分的90%以上），从而同时产生渗透效应和离子效应。每种盐度条件都在单泡柱反应器中进行了测试

CRediT作者贡献说明

Bedirhan I??k：撰写原始稿件、数据可视化、方法设计、实验实施、概念构思。Altan Ozkan：参与论文审阅与编辑、撰写原始稿件、方法设计、实验实施、资金申请以及概念构思。

利益冲突声明

作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本研究得到了土耳其科学技术研究委员会（TUBITAK）的资助，项目编号为219M564。作者们对TUBITAK的资助表示感谢。同时，作者们还要感谢伊兹密尔工业技术研究院的综合研究中心（包括生物技术及生物工程应用研究中心以及环境发展、应用研究中心），感谢他们为纳米纤维分析工作提供的研究基础设施。

Bedirhan I??k|Altan Ozkan