肽整合牛血清白蛋白水凝胶作为电化学检测血清中心肌肌钙蛋白I的协同抗污策略

《Analytica Chimica Acta》：Peptide-Integrated Bovine Serum Albumin Hydrogel as a Synergistic Antifouling Strategy for Electrochemical Detection of Cardiac Troponin I in Serum

　　

摘要

在复杂的生物样本中，电化学生物传感器常常会遭遇生物污垢问题，这会影响检测精度并限制其实际应用。为解决这一问题，我们通过将牛血清白蛋白水凝胶与一种设计好的多功能肽结合，开发出一种具有协同抗污作用的生物传感器，用于在复杂生物流体中检测心肌肌钙蛋白I。利用基于牛血清白蛋白的一步交叉链接方法，构建出了稳定且多功能的抗污层，而BSA富含氨基的表面使得多功能肽能够二次接枝到该层上，这种肽兼具锚定、抗污和识别功能。该方法不仅提升了涂层的抗污性能和耐用性，还避免了引入外源识别分子可能带来的干扰。通过电化学测量和荧光成像，系统验证了这一分层界面的协同抗污效果，结果显示其在各种生物流体中都具有出色的抗污能力。所制备的生物传感器具备长期稳定性，灵敏度较高，在0.1 pg·mL^?1至100 ng·mL^-1范围内可实现宽线性响应，检测下限可达0.042 pg·mL^?1。总体而言，本研究提出了一种高效且可推广的界面工程策略，显著提升了生物传感器的抗污性能和分析可靠性，为其在复杂生物环境中的临床监测应用奠定了良好基础。

引言

心肌肌钙蛋白I是诊断心肌损伤这一严重心血管疾病的关键生物标志物[1]、[2]。这类损伤通常由冠状动脉严重堵塞引起，从而导致心肌的血液供应和氧气供应不足[3]、[4]、[5]。随后心肌细胞受损，会导致cTnI释放到血清中。因此，检测血清中的cTnI对于早期诊断心肌损伤及评估其严重程度至关重要。

目前已有多种分析方法可用于cTnI的定量检测，比如电化学检测[6]、表面等离子体共振技术[7]、荧光光谱法[8]、化学发光免疫分析法[9]、比色分析法[10]等。其中，电化学生物传感器因其高灵敏度、便携性和低成本等优点，在生物医学研究中得到了广泛应用，展现出巨大的潜力[11]、[12]、[13]。然而，真实血清样本中存在的大量蛋白质和细胞会非特异性吸附在传感器表面，造成严重的表面生物污垢，进而阻碍界面电子传输，最终影响传感器的稳定性和灵敏度[14]。因此，开发具有抗污功能的电极界面对于在生物流体中实现准确检测极为重要。

为应对这一挑战，牛血清白蛋白成为构建抗污表面的理想材料。BSA由583个氨基酸和17个二硫键组成，具有稳定的三维球状结构[15]。其分子表面同时存在亲水区和疏水区，这有助于其与各种物质发生相互作用[16]、[17]。亲水区域（富含天冬氨酸和谷氨酸）可通过水分子间的氢键形成致密的水化层，有效抑制蛋白质、细菌及其他生物污染物在界面上的非特异性附着[18]。与此同时，疏水区域则有助于将BSA牢固地固定在基底表面[19]。再加上BSA成本低廉且生物相容性优异，这些特性使其在生物医学领域得到广泛应用[20]。此外，BSA表面还存在氨基、羧基和巯基，便于进行化学修饰和交叉链接[21]。利用这些性质，BSA可以通过化学交叉链接形成水凝胶。在常用的交叉链接剂中，戊二醛因其成本较低且能形成稳定的共价键而尤为实用[22]。戊二醛可与BSA中赖氨酸残基的ε-氨基发生反应，形成分子间交叉链接，从而生成基于BSA的水凝胶BSAG[23]。虽然经BSA水凝胶改性的传感器界面具有短期的抗污能力，但由于其固有的负电荷和疏水区域，其长期稳定性仍会受到影响[24]、[25]。此外，长时间接触生物流体还可能导致BSA的构象发生变化，进而削弱其抗污能力[26]。因此，提升BSAG的抗污性能对于实现血清中心肌肌钙蛋白I等目标物质的直接准确检测至关重要。

一种有效的解决方案是用水凝胶与其他抗污材料相结合。在众多候选材料中，肽类因其优异的生物相容性、可调控的结构以及易于修改的特点，被视为极具潜力的材料[27]、[28]。尤其是两性离子肽，由于含有比例适中的带正电的赖氨酸残基和带负电的谷氨酸残基，能够形成稳定的水化层，同时其电中性特性可有效抑制非特异性蛋白质的吸附，因而具有出色的抗污性能[29]、[30]。此外，若将两性离子肽设计成分支结构，还能形成更密集、更厚的水化层，进一步提升其抵抗非特异性吸附的能力[31]、[32]。分支肽的另一个优点是，其某些分支可以被设计为特定目标的识别序列，从而简化抗污生物传感器的构建过程。

在本研究中，我们通过将BSAG与设计好的分支肽相结合，构建了一种高效的抗污生物传感器，用于在复杂生物样本中检测生物标志物。首先，用电沉积聚苯胺对电极进行改性，然后再涂覆BSAG。为进一步提升改性电极的抗污能力，我们在BSAG层上引入了设计好的分支肽（见图1）。更为重要的是，为避免额外识别元件（如适配体或抗体）可能带来的抗污干扰，该设计肽在其结构中整合了针对cTnI的特异性识别序列。这种多功能分支肽由三部分组成：锚定序列CPPPP、抗污序列EKEKEKEK以及针对cTnI的识别序列FYSHSFHENWPSK[33]。该肽通过其末端的巯基与BSA的氨基相结合，从而形成了具有协同抗污功能的肽集成BSAG复合改性电极。与仅经过BSA改性的电极相比，这种肽集成BSAG改性电极的抗污稳定性显著提升，能够在复杂生物流体中实现cTnI的准确长期检测。

章节节选

试剂

所设计的分支肽((KSPWNEHFSHSYFKEKEKE)₂KEPPPPC)购自中国合肥斯克瑞博有限公司，其分子结构如图S1所示。苯胺和磺基-SMCC购自中国上海的阿拉丁公司。高氯酸由中国北京的国药集团提供。cTnI则由中国上海的林克-生物科学公司提供。BSA购自中国上海的亚当斯试剂公司。戊二醛和溶菌酶则来自中国上海的麦克林试剂公司。

生物传感器的构建与表征

电沉积得到的聚苯胺薄膜具有优异的电导率和稳定性，为后续BSAG和设计肽的组装提供了良好的基底。如图1A的扫描电子显微镜图像所示，聚苯胺薄膜呈现出多孔的颗粒状结构，这增加了裸露的石墨电极的电化学活性表面积。BSAG/聚苯胺改性界面的表面形态也通过扫描电子显微镜进行了表征，结果如图1B所示。

结论

综上所述，我们开发了一种基于BSAG和设计肽的协同抗污传感界面的电化学生物传感器。这种协同抗污界面能有效抑制复杂生物流体中蛋白质及其他干扰物的非特异性吸附，从而为cTnI的准确检测提供可靠的传感表面。该生物传感器具有高灵敏度、优异的选择性以及良好的长期稳定性。

CRediT作者贡献说明

宋震：写作——审阅与编辑、指导、项目管理、资金获取、概念构思。王佩佩：方法学、实验研究、数据整理。罗晓亮：写作——审阅与编辑、指导、资源协调、项目管理、资金获取、概念构思。吕少鹏：写作——审阅与编辑、指导、资源协调、概念构思。杜秋书：写作——初稿撰写、实验研究、正式分析、数据整理、概念构思

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：22504068、22374085）、青岛市自然科学基金和山东省自然科学基金支持的重大项目（编号：ZR2025MS121）的资助。

杜秋书|王佩佩|宋震|罗晓亮|吕少鹏

中国山东省青岛市266042，青岛科技大学化学与分子工程学院