基于DNA四面体与双金属纳米复合材料的AFB检测用双信号比电化学传感器

《Analytical Biochemistry》：A dual signal ratio electrochemical sensor based on DNA tetrahedrons and bimetallic nanocomposites for AFB 1 analysis

　　

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  NGR-HP-AgPt与DNA四面体共同构成3D轨道，避免探针相互缠绕。
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  由Exo III驱动的DNA行走器可实现AFB₁的双信号比率检测。
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  内置的自校准功能可有效消除假阳性干扰。
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  该检测方法灵敏度极高（检测限为73.99?fg/mL），可应用于复杂样品中。

引言

黄曲霉毒素B₁（AFB₁）是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，被誉为自然界中最具毒性且致癌性最强的霉菌毒素之一[[1], [2], [3], [4]]。由于其稳定性强且在农产品、食品及草药中普遍存在，AFB₁对全球食品安全和人类健康构成了严重威胁[[5], [6], [7]]。即便长期暴露于微量AFB₁，也可能会引发不可逆的肝脏损伤和肝细胞癌[8,9]。因此，开发出高灵敏度、精准且快速的检测方法，对于确保食品质量、实现临床诊断以及保护公共卫生具有至关重要的意义。

目前，高效液相色谱法（HPLC）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等传统检测方法因其可靠性而被广泛使用[[10,11]]。然而，这些方法存在诸多固有缺陷，比如预处理流程耗时较长、需要昂贵设备以及依赖专业操作人员，这些都限制了它们在快速现场检测中的应用[[12], [13], [14], [15], [16]]。近年来，电化学适配体传感器因响应迅速、灵敏度高且易于微型化而成为极具前景的替代方案[[17], [18], [19]]。不过，传统的单信号电化学传感器容易受到环境因素变化（如pH值和温度波动）、电极活性表面积的不均匀性以及实际样品中的复杂基质效应的影响[[20], [21], [22]]。这些干扰因素会导致信号失真，进而产生假阳性或假阴性结果，影响检测的准确性和可靠性。

通过使用两种对目标物质呈现相反且相关变化趋势的电活性分子，比率检测策略能够构建出一个稳定的内部参考系统。正如最新研究所示[[23,24]]，这种双信号输出方式可以通过数学运算抵消系统误差和基线漂移，从而显著提升定量分析的抗干扰能力、重复性及可靠性，远优于传统单信号传感器。此外，通过构建“开-关”模式的比率传感器，让目标物质触发一个信号的上升同时另一个信号下降，可以大幅增强信号的变化幅度[[25,26]]。将这两种相反的趋势转化为单一比例后，传感器的灵敏度、选择性和抗干扰能力都会得到显著提升，为在复杂实际样品中准确测定AFB₁奠定了坚实基础。

除了准确性之外，拥有超灵敏的检测界面也是实现优秀传感器性能的关键。为此，设计出具有高导电性且富含活性位点的检测基底至关重要[[27,28]]。在本研究中，研究人员精心设计并合成了氮掺杂氧化石墨烯（NGR）支撑的空心银铂双金属纳米球（HP-AgPt）[[29]]。与传统固体纳米材料相比，HP-AgPt纳米球具有空心核壳结构，这不仅能为小分子提供更大的比表面积和更均匀的环境，还能最大限度地利用铂原子，促进银和铂纳米粒子之间的协同催化与电子效应[[30,31]]。与此同时，NGR凭借其广阔的功能性表面积以及氮掺杂带来的大量自由电子，可作为一种优异的导电基质[[32]]。NGR与HP-AgPt的巧妙结合能够协同加速界面电子转移，大幅提高捕获探针的负载量，从而为后续信号转换奠定高灵敏度的基础。

为进一步突破灵敏度极限，本研究还将动态DNA纳米技术，尤其是DNA行走器信号放大策略，引入到了检测系统中。作为一种自主运行的分子机器，DNA行走器能够在特定酶的驱动下沿着预设轨道持续移动，通过将单一分子识别事件转化为多个输出信号，实现显著的信号放大效果[[33,34]]。不过，传统的单链DNA探针往往会在电极表面出现空间缠绕现象，从而影响其移动效率。为解决这一问题，研究团队采用了刚性的DNA四面体（TDNA）作为轨道支架，它能够为DNA行走器提供良好的空间定位和结构稳定性，使其能够顺畅运行，进而精确控制动态切割过程，大幅提升检测灵敏度。

借助基于纳米材料基底强化与动态DNA信号放大的协同优势，本研究成功开发出一种新型的“开-关”模式比率电化学适配体传感器，可用于超灵敏且高精度地检测AFB₁。具体而言，该传感器利用NGR-HP-AgPt纳米复合材料来加速电子转移，并固定大量TDNA轨道。当AFB₁与适配体竞争结合时，行走链（DNA1）会被释放出来，与信号探针（Cd²⁺-DNA2）配对。随后，外切核酸酶III被引入以启动DNA行走器，持续切割信号探针并释放DNA1，进入下一循环。这一循环过程会导致溶液中的Cd²⁺信号（内部参考信号）显著下降，同时界面电阻也会随之降低，进而使甲苯胺蓝（TB，信号分子）的峰电流上升。通过检测两种信号的比值（I_TB/I_{Cd²⁺），可以有效避免信号波动和假阳性结果。这种将NGR-HP-AgPt与TDNA引导的DNA行走器策略相结合的创新方法，有效解决了现有方法的局限性，展现出在实际食品和草药样品中检测AFB1时的卓越灵敏度、准确度及实用价值。}

章节要点

实验试剂与材料

适配体、DNAa、DNAb、DNAc、DNAd、DNA1和DNA2均由上海桑根生物工程技术服务有限公司合成，并通过高效液相色谱法进行纯化（中国上海）。其序列如下：适配体：GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA。DNA-a：SH-C₆-TTC AGA CTT AGG TGT GCT TCC CAC GGT GTC GTT TGT AGG ACC CTC GCA T。DNA-b：SH-C₆-TCC TGC CTG GTG ATA AAA CGA CAC CGT GGG AAT CTA CTA TGG CGG CTC C。DNA-c：SH-C₆-TAT CAC CAG GCA GGA CAG TGT AGC AAG CTG TTA GAT GCG

基于NGR-HP-AgPt与DNA行走器信号放大的AFB₁电化学检测原理

本研究通过将NGR-HP-AgPt纳米复合材料与刚性四面体DNA纳米结构（TDNA）相结合，构建了一种先进的比率电化学传感器，用于精准测定AFB₁（见图1）。NGR-HP-AgPt纳米复合材料不仅能够显著提升电催化导电性，还能增加捕获探针的负载容量。之后，TDNA被固定在经过改性的电极表面上。

结论

综上所述，通过将3D NGR-HP-AgPt纳米复合材料与Exo III辅助的DNA行走器有机结合，本研究成功构建了一种双信号比率电化学生物传感器，可实现AFB₁的超灵敏且精准检测。NGR独特的皱褶结构与HP-AgPt的空心双金属结构相结合，显著提升了电极的活性表面积和界面电子传输效率。尤为重要的是，采用刚性DNA四面体作为轨道

作者贡献说明

郭亮：数据整理、资金获取、方法设计、结果验证、初稿撰写。赵丽英：数据整理、正式分析、资金获取。周世金：实验研究、结果验证、初稿撰写。刘艳菊：正式分析、实验研究。孔金明：概念设计、项目监督、论文审阅与修改。杨怀霞：方法设计、结果验证、论文审阅与修改。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本研究得到了中国博士后科学基金会（编号：2025M783548）、河南省重点科学技术攻关项目（编号：262102310340）以及国家自然科学基金（编号：51903248）的支持。

Liang Guo|Liying Zhao|Shijin Zhou|Yanju Liu|Jinming Kong|Huaixia Yang