《Analytica Chimica Acta》：Combining sandwich and competitive immunoassay formats in a duplex lateral flow test for rapid iron-status assessment
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背景：可靠的铁状态评估得益于互补生物标志物的联合测量，但在快速侧流层析格式中的实施因生物标志物浓度范围和检测行为的巨大差异而变得复杂。可溶性转铁蛋白受体（sTfR）的生理浓度显著高于铁蛋白（ferritin），这导致在传统夹心法侧流层析测试（LFA）中存在高剂
背景：可靠的铁状态评估得益于互补生物标志物的联合测量，但在快速侧流层析格式中的实施因生物标志物浓度范围和检测行为的巨大差异而变得复杂。可溶性转铁蛋白受体（sTfR）的生理浓度显著高于铁蛋白（ferritin），这导致在传统夹心法侧流层析测试（LFA）中存在高剂量钩状效应（hook effect）的风险。
结果：在此，研究人员报道了一种混合格式双重侧流层析测试（LFA），用于人血浆中铁蛋白和可溶性转铁蛋白受体的同时定量测量。该检测将铁蛋白的夹心法免疫分析与可溶性转铁蛋白受体的间接竞争性免疫分析整合在单一测试条上。通过使用光谱不同的上转换纳米颗粒（UCNP）报告子和空间分离的测试线实现了定量读数。最终的双重检测显示铁蛋白的检测限为0.25 ng/mL，可溶性转铁蛋白受体的检测限为0.1 μg/mL，并在宽泛的功能动态范围内实现了定量测量。该检测大约在12分钟内完成，并使用健康成年捐赠者的锂肝素血浆样本进行了评估。结果显示两种生物标志物与常规中心实验室参考方法具有分析兼容性。
意义：这些发现表明，在单个侧流层析装置中结合竞争性和非竞争性免疫分析格式可以克服多重即时检测（PoC）中的动态范围和钩状效应限制。混合格式双重检测为铁状态评估提供了一种快速定量方法，在献血者筛查和实验室基础设施有限的环境中具有潜在应用。
铁缺乏（ID）是全球普遍的营养障碍，影响数百万个体，尤其易发于常规献血者。常规筛查常用血红蛋白（Hb）测量，但贫血可能由铁状态无关的疾病引起，因此Hb不足以诊断铁缺乏。联合评估铁蛋白（ferritin，反映体内铁储存）和可溶性转铁蛋白受体（sTfR，反映组织铁需求和红细胞生成活性）可提高缺铁性贫血的识别可靠性，例如通过sTfR/log ferritin比值。铁蛋白在炎症或肝病中可能升高，而sTfR受炎症影响较小。临床实验室使用自动免疫化学方法（如电化学发光法、免疫比浊法）进行测量，但这些方法需要集中化设备、训练人员和样本物流，不适合即时检测（PoC）场景。侧流层析测试（LFA，一种纸基快速检测技术）具有简单、快速、成本低等优点，但传统LFA依赖视觉判读，灵敏度和定量能力有限。上转换纳米颗粒（UCNP，一类在近红外激发下发射可见光的纳米材料）可提高灵敏度并实现多重检测，但其在多重LFA中的应用面临挑战：铁蛋白浓度在低ng/mL范围，而sTfR在较高μg/mL范围，且sTfR在传统夹心法中易出现高剂量钩状效应（hook effect，高浓度导致信号抑制的现象）。因此，需开发一种混合格式LFA，同时克服动态范围和钩状效应限制。研究人员开展了本研究，开发了一种混合格式双重LFA，将铁蛋白夹心免疫分析与sTfR间接竞争免疫分析整合在单一测试条上，使用光谱不同的UCNP报告子和空间分离的测试线，实现快速定量检测。该检测实现了铁蛋白检测限0.25 ng/mL、sTfR检测限0.1 μg/mL，宽动态范围，12分钟内完成，并通过健康成年捐赠者锂肝素血浆样本（n=17）验证了与中心实验室参考方法的分析兼容性。该研究证明结合竞争性和非竞争性免疫分析格式可克服多重PoC测试中的动态范围和钩状效应限制，为铁状态快速评估提供新方法，论文发表在《Analytica Chimica Acta》。
主要关键技术方法包括：使用光谱不同的Er-掺杂UCNP（发射540 nm）和Tm-掺杂UCNP（发射460 nm）作为报告子，通过EDC/sulfo-NHS化学将抗铁蛋白单克隆抗体（F23cc）和抗sTfR单克隆抗体（11F5cc）分别偶联至UCNP。测试条制备：将抗铁蛋白抗体（夹心法）和重组sTfR（竞争法）分别打印在硝酸纤维素膜上作为测试线，并组装样本垫和吸收垫。使用便携式上转换发光（UCL）读数仪在465/50 nm和540/60 nm带通滤波器下分别读取Tm和Er信号。样本来源为健康成年捐赠者（n=17）的锂肝素血浆，经中心实验室参考方法（电化学发光法测铁蛋白，Tina-quant可溶性转铁蛋白受体II检测测sTfR）进行对比。
研究结果如下：
- 光谱分离的UCNP报告子用于双重读数：通过透射电镜（TEM）表征，Er-UCNP平均直径44 nm，Tm-UCNP平均直径30.7 nm。发射光谱测量显示两者在测量范围内无显著重叠，可在465/50 nm和540/60 nm带通滤波器下分别检测，实现光谱分离的双重读数。
- 双重LFA中的检测通道特异性：通过分析铁蛋白和sTfR校准实验数据评估通道特异性。铁蛋白仅在铁蛋白测试线（T2）的540 nm信号中产生浓度依赖性增加，sTfR测试线（T1）信号无变化；sTfR仅在T1的460 nm信号中产生预期逆响应，T2信号无变化。表明交叉反应极小，通道特异性良好。
- 选择间接竞争格式检测sTfR以避开钩状效应：研究先评估了夹心法检测sTfR，在浓度高于约2.5 μg/mL时出现信号抑制（高剂量钩状效应），而缺铁性贫血相关sTfR浓度可超过3 μg/mL，因此夹心法不适用。采用间接竞争免疫分析格式后，该格式在宽浓度范围内提供单调逆信号响应，避免钩状效应。优化了样本当量体积（25 μL）和测试线负载（200 ng/cm重组sTfR），获得良好竞争响应。
- 混合格式双重LFA的分析性能：在最终双重配置下测量校准曲线。铁蛋白检测限0.25 ng/mL，sTfR检测限0.1 μg/mL。铁蛋白校准曲线呈单调递增，浓度1 ng/mL以上变异系数（CV）≤10%；sTfR校准曲线呈单调递减，CV<10%覆盖整个评估范围（0.1–50 μg/mL）。表明多重检测未影响灵敏度，且动态范围覆盖临床相关浓度。
- 使用双重LFA分析人血浆样本：对17名健康捐赠者血浆样本进行测量，与中心实验室参考方法比较。铁蛋白LFA测量值与参考方法线性相关（r=0.916，p<0.001），Bland-Altman分析显示平均偏倚1.9 ng/mL，95%一致性界限-57至61 ng/mL。sTfR测量值与参考方法线性相关（r=0.903，p<0.001），平均偏倚-1.1 μg/mL，95%一致性界限-0.6至-1.7 μg/mL。sTfR偏倚反映了跨方法差异的已知问题，表明分析兼容性。
- 用于即时检测铁状态评估的快速检测工作流程：通过比较五种硝酸纤维素膜和两种吸收垫材料，优化了流动速度。最终选择70CNPH-N-SS40膜与CF6吸收垫，总迁移时间约12分钟，且未影响检测限和动态范围。该工作流程满足PoC应用的快速要求。
总结讨论部分：该混合格式双重LFA解决了铁蛋白和sTfR多重检测中的动态范围和钩状效应挑战，展示了不同免疫分析格式整合的可行性。该检测快速、定量，与实验室方法兼容，适用于PoC铁状态评估，尤其在献血者筛查和资源有限环境中具有潜力。研究结论部分翻译如下：研究人员开发了一种混合格式双重侧流层析测试（LFA），结合了铁蛋白的夹心免疫分析和可溶性转铁蛋白受体（sTfR）的间接竞争免疫分析，实现了对两种分析要求显著不同的互补铁状态生物标志物的同时定量测量。该架构解决了铁蛋白-sTfR多重检测中的两个主要挑战：在低ng/mL浓度下灵敏检测铁蛋白的需求，以及避免在较高μg/mL浓度下sTfR测量中的高剂量钩状效应。该双重检测实现了互补铁状态标志物的稳健定量读数。该检测在12分钟内提供结果，并使用人血浆样本证明了与常规实验室测量的分析兼容性。总之，这些结果突显了多重侧流层析测试（LFA）架构在即时检测（PoC）铁状态评估中的潜力，特别是在需要快速筛查和最少实验室基础设施的应用中。
