《Analytica Chimica Acta》：DNA sensor-engineered nanovesicles for multi-logic-cascaded signal-amplified miRNA imaging
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摘要肿瘤相关miRNA的浓度较低，且存在显著的背景信号干扰，这凸显出实现敏感、精准的miRNA成像的必要性。在此，我们报道了一种基于DNA传感器的纳米囊泡，该纳米囊泡通过结合多级响应策略与基于催化发夹组装的信号放大策略，实现了对目标miRNA-21的敏感精准成像。该DNA传感器由
摘要
肿瘤相关miRNA的浓度较低，且存在显著的背景信号干扰，这凸显出实现敏感、精准的miRNA成像的必要性。在此，我们报道了一种基于DNA传感器的纳米囊泡，该纳米囊泡通过结合多级响应策略与基于催化发夹组装的信号放大策略，实现了对目标miRNA-21的敏感精准成像。该DNA传感器由谷胱甘肽响应序列、目标识别序列、CHA发夹结构以及DNA桥接序列构成。当谷胱甘肽与目标miRNA-21同时存在时，可触发二硫键断裂，进而引发目标介导的CHA循环反应。该传感器在缓冲液中的检测范围为10 pM至1?nM，检测限为3.9 pM。负载有该DNA传感器的纳米囊泡表面经过叶酸修饰。这种基于DNA传感器的纳米囊泡既能通过外源叶酸实现肿瘤细胞的识别，又能通过内源谷胱甘肽激活目标诱导信号放大，从而显著提升对目标miRNA-21成像的灵敏度和精确度。
引言
微小RNA作为短链非编码RNA生物分子，在真核生物的基因表达及多种生物过程中起着关键的调控作用[1,2]。研究表明，异常的miRNA表达与多种人类疾病密切相关，尤其是在癌细胞中，其表达会促进肿瘤的发生、发展及转移，因此检测癌细胞中miRNA的表达水平对于癌症的诊断和治疗具有重要意义。然而，细胞内miRNA的浓度较低，这一难题给检测工作带来了挑战[3,4]，因此开发出灵敏、精准的miRNA检测方法显得极为必要[5,6]。
基于DNA的传感器已被广泛用于miRNA的检测和成像。为实现高灵敏度检测，人们采用了聚合酶链反应、滚动环扩增、杂交链反应以及催化发夹组装等多种信号放大策略来构建DNA传感器，从而实现对miRNA的高灵敏度检测。其中，催化发夹组装是一种典型的等温自由能驱动反应，具有放大效率高、生物相容性好、使用简便且成本低等优点[12]。为避免出现假阳性信号，人们还采用了刺激-响应策略来构建DNA传感器[13]。尤其是谷胱甘肽激活型的传感器受到了广泛关注。在细胞内，谷胱甘肽是一种含量丰富的低分子量抗氧化剂，对细胞的正常功能与生长起着重要作用[14]。在动态平衡状态下，谷胱甘肽主要存在于细胞内部，浓度约为2-10?mM，而细胞外部的浓度则在2到40?μM之间[15]。值得注意的是，肿瘤细胞中的谷胱甘肽浓度是正常细胞的四倍，这使得它成为癌症诊断中最重要的信号分子之一。因此，开发一种基于谷胱甘肽激活机制且采用催化发夹组装策略的DNA传感器，是实现细胞内目标物高灵敏度、精准成像的有效途径[16]。
接下来，将DNA传感器递送至细胞质是其实现miRNA高灵敏度、精准成像的关键。由于DNA传感器容易被溶酶体捕获并滞留，难以进入细胞质，这大大限制了它们与miRNA的接触机会，进而降低了检测效率[17]。此外，溶酶体内的酸性环境以及大量水解酶的存在也会导致DNA传感器被降解。因此，开发有效的DNA传感器递送系统至关重要[18,19]。纳米囊泡因其化学多样性、物理稳定性以及表面功能性，在纳米医学领域极具应用价值[20,21]。基于聚乙二醇的纳米囊泡因其出色的生物相容性、抗核酸酶降解能力以及能够增强细胞摄取功能，而被广泛应用于细胞研究领域[22]。1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺磷脂的疏水层与细胞膜磷脂双层结构极为相似，这有助于促进膜间相互作用与融合[23]。基于这些特性，我们推测DSPE-PEG是一种可用于构建用于递送DNA传感器的纳米囊泡的理想材料。另外，叶酸能够特异性结合癌细胞上过表达的叶酸受体，从而为纳米囊泡在癌细胞内的递送提供便利[24]。因此，在本研究中，我们旨在利用经DSPE和叶酸共同修饰的聚乙二醇制备出基于DNA传感器的纳米囊泡，以实现高灵敏度、高精准度的miRNA成像。以肿瘤相关的miRNA-21作为模型，我们通过GH1、H2和S1三条链构建了该传感器（见图1a）。其中，GH1链包含谷胱甘肽响应位点、目标识别序列以及CHA发夹序列；S1链则作为DNA桥接序列，能够提高CHA发夹的碰撞效率，进而加快CHA反应的速率。重要的是，该传感器被封装在由DSPE和叶酸共同修饰的聚乙二醇组装而成的纳米囊泡中（见图1b），这一设计提升了DNA传感器在细胞质中miRNA-21所在位置的浓度。在用于miRNA-21成像时，这些基于DNA传感器的纳米囊泡可通过叶酸-叶酸受体被癌细胞内吞。肿瘤细胞中过量的谷胱甘肽可触发二硫键断裂，从而使目标识别序列释放出来，进而引发目标介导的CHA循环反应，最终实现miRNA-21的成像（见图1c）。由此可见，通过结合多级响应策略与基于CHA的信号放大策略，基于DNA传感器的纳米囊泡能够为目标的精准成像提供理想的平台。
章节节选
DNA传感器的制备
所有寡核苷酸序列均在TE缓冲液（10?mM Tris、0.1?mM EDTA，pH 8.0）中制备，最终浓度为100?μM。反应缓冲液的组成为50?mM Tris-HCl、100?mM NaCl、10?mM MgCl2，pH值为8.5。GH1和H2这两种发夹结构在95°C下退火5分钟，随后在4°C下冷却2小时，从而形成相应的发夹结构。传感器支架的组装步骤如下：将2?μL的GH1、2?μL的H2以及2?μL的S加入离心管中，然后在37°C下孵育2小时。冷却之后
谷胱甘肽激活型DNA传感器的工作原理
该谷胱甘肽激活型DNA传感器是由GH1、H2和S1三条链构成的（见表S1）。我们通过天然凝胶电泳技术研究了该传感器的组装过程。在图S1中，第1至3条泳道分别显示了单链形式的GH1、H2和S1。S1与H2形成的双链杂交体（第4条泳道）的迁移速度比单链形式要慢。类似地，S1与GH1形成的杂交产物则显示在第5条泳道中。GH1与H2的混合溶液则对应第6条泳道。而GH1、H2和S1三条链共同形成的三链杂交体的迁移速度则更慢
结论
综上所述，我们通过结合多级响应策略与信号放大策略，成功开发出一种DNA传感器，可实现目标miRNA-21的高灵敏度、精准检测。在同时存在谷胱甘肽和miRNA-21的情况下，谷胱甘肽会切断GH1发夹中的二硫键，引发其构象变化，进而启动CHA循环反应，从而实现对miRNA-21的高灵敏度（检测限为3.92 pM）且高特异性的检测。为了进一步提升其在细胞内的递送效率
作者贡献声明
何娇：数据整理、定量分析、实验研究、方法设计、初稿撰写、论文润色修改。姚淑芬：数据整理、实验研究。孟英林：数据整理、实验研究。陈峰：资金获取、实验研究、项目管理、论文润色修改。赵春辉：数据整理、定量分析、实验研究、方法设计、论文润色修改。陈春燕：方法设计、资源准备。龚航：方法设计、资源准备。蔡长群：
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（编号：22404139）以及湖南省国家自然科学基金（编号：2025JJ60075）的支持。
Jiao He|Shufen Yao|Yinglin Meng|Feng Chen|Chunhui Zhao|Chunyan Chen|Hang Gong|Changqun Cai
湖南省绿色有机合成与应用重点实验室、教育部绿色化学与应用重点实验室、湘潭大学化学学院，中国湘潭市411105
