基于HiBiT纳米荧光素酶报告系统的细胞模型用于HBV cccDNA抑制剂高通量筛选的开发

《Antiviral Research》：Development of a Cell-based Nanoluciferase Reporter System for High-Throughput Screening of HBV cccDNA Inhibitors

　　

研究人员开发了HepBLE12，一种新型HBV cccDNA依赖型HiBiT纳米荧光素酶（nanoluciferase）报告细胞系。HepBLE12表现出稳健的HBV DNA复制及经验证的cccDNA依赖性HiBiT信号。该检测被微型化至384孔板格式并针对高通量筛选（HTS）进行了优化。自动化先导HTS显示出优异性能，具有高空白比（S/B）、低变异系数（CV）及0.74的Z因子。

研究背景方面，慢性乙型肝炎（CHB）由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起，全球超过2.96亿人慢性感染，每年约82万人死亡。现有核苷（酸）类似物或干扰素-α疗法难以清除肝内共价闭合环状DNA（cccDNA）微染色体，而cccDNA是HBV建立与持续感染的核心组分，也是治愈CHB的主要屏障。开展针对cccDNA形成、稳定性或转录活性的新药筛选亟待可靠模型。既往研究人员构建了第一代HepDE19与第二代HepBHAe82细胞系，利用cccDNA依赖分泌的HBeAg作为读值，但ELISA免疫检测不利于HTS且分泌HBeAg与细胞内cccDNA非线性相关。为此，研究人员基于HiBiT技术（11氨基酸拆分纳米荧光素酶标签，与LgBiT互补发光）开发第三代cccDNA依赖报告细胞系HepBLE12，并将检测微型化至384孔HTS格式，在《Antiviral Research》报道该平台。

关键技术方法上，研究人员采用Tet-off诱导型HBV复制骨架pTREHBVDE，在precore（pC）ORF信号肽后、核心（C）ORF起始密码子前框内插入HiBiT序列，同时突变pC 5′端ATG为TG，使HiBiT-pC ORF仅在pgRNA逆转录成rcDNA并环化为cccDNA后重建；通过G418筛选HepG2/pTet-off稳定共转染克隆获HepBLE12。平台验证使用已知抑制剂（3TC、GLS-4、AT-61、MS436）、HBV进入抑制剂Myrcludex B（MyrB）及HepG2-NTCP感染模型；HTS端采用384孔白壁不透明板、20,000细胞/孔、1% DMSO耐受、LOPAC1280化合物库先导筛选，并以HepAD38作背景对照、Z因子/CV/S/B评估。

研究结果部分，3.1节工程化可诱导复制胜任HBV基因组载HiBiT-pC ORF：瞬转验证pHiBiT复制水平与野生型相当，ε茎环碱基配对保留。3.2节HiBiT-pC/HBeAg表达检测：瞬转pcHiBiT-HBe获胞内HiBiT-pC（Western及裂解发光~400 RLU），分泌HiBiT-HBeAg较弱；稳定株HepLE6证实组成型表达可行。3.3节Tet诱导HepBLE12表征：Southern blot（热变性+EcoRI+外切酶）确证cccDNA；时序分析第4天起core DNA/cccDNA/HiBiT信号同步上升；qPCR cccDNA拷贝、RT-qPCR pC mRNA与HiBiT-pC蛋白三者时程高度相关；HepBLE12产HiBiT-HBV病毒颗粒感染HepG2-NTCP可被MyrB阻断。3.4节参比抗病毒物评估：GLS-4（CAM-A）、AT-61（CAM-E）阻遏pgRNA封装、3TC阻逆转录，均消去HiBiT信号；Tet+3TC关闭新cccDNA后MS436（BRD4抑制剂）下调pC mRNA与HiBiT信号，证明已建cccDNA转录可被打断。3.5节HTS检测开发：384孔密度梯度选定20,000细胞/孔、裂解试剂孵育2 h；1% DMSO无毒；MS436 IC₅₀~10 μM；不透明板优于透明底板（避光损、传代稳定）。3.6节三日变异性：连续三周双板（HepBLE12 MAX/HepAD38 MIN）1% DMSO处理，CV<15%、Z′>0.5。3.7节LOPAC先导筛选：1280化合物10 μM双复孔，平均Z因子0.74±0.06、S/B 9.1、复孔r²=0.92，命中19个（1.5%，>20%抑制）。

讨论部分总结：研究人员指出紧凑HBV基因组仅容忍极小插入，HiBiT（11 aa）是当前最小实用发光标签；选用胞内HiBiT-pC而非分泌HiBiT-HBeAg作读值，因前者直接由cccDNA来源pC mRNA翻译、信背比更高且避开了HBeAg加工/分泌间接假阳性。HepBLE12 cccDNA动力学与已知抑制剂表型一致，MS436仅作表观遗传正向对照。384孔微型化通过细胞密度、孵育时间与EnVision高敏读值弥补信号压缩；不透明板保障长周期HTS稳定；LOPAC验证显示平台具备灵敏度、重复性、可扩展性与机制特异性。结论翻译为：HepBLE12 cccDNA-HiBiT平台满足HTS部署关键标准（敏感性、重复性、可扩展性及机制特异性），其精简“加样-读取”格式结合cccDNA的定量发光读值，使其成为大规模抗HBV cccDNA药物发现的实用可靠工具。