锚珊瑚蛇Micrurus ancoralis的毒液组学：组成、毒理学特征及商业抗蛇毒血清的中和作用

《Tropical Medicine and Infectious Disease》：Venomics of the Anchor Coral Snake Micrurus ancoralis: Composition, Toxicological Profile, and Neutralization by Commercial Antivenom

　　

美洲大陆的珊瑚蛇被划分为两个属：Micruroides 和 Micrurus，后者已识别多达91个物种。尽管由 Micrurus 引起的蛇咬中毒较为罕见，但由于其神经毒性效应导致弛缓性麻痹和潜在的呼吸衰竭，可能危及生命。Micrurus ancoralis 分布于哥伦比亚的太平洋低地和西部科迪勒拉山脉西坡。尽管该物种在其分布范围内相对常见，但其系统发育位置和毒液特征尚未被研究。系统发育分析结果将 M. ancoralis 置于具有特征性三联模式和三色组的 triadal/bicolor 支系中。毒液的蛋白质组学特征显示其组成中以磷脂酶 A2 (PLA2) 酶为主，占总蛋白含量的51.7%，其次是三指毒素 (3FTxs; 23.2%)，以及较低比例的属于其他几个次要家族的蛋白质。在获得的28个色谱毒液组分中，对7个最丰富的组分进行了毒性评估，其中三个组分（F7，鉴定为3FTx；F18和F20，均鉴定为PLA2）在经腹腔注射途径的小鼠中显示出致死活性。F20的PLA2活性得到确认，并证明了其在小鼠中诱导水肿、肌毒性和致死效应。一种针对珊瑚蛇咬伤的治疗性马抗珊瑚蛇毒血清（INS，哥伦比亚）在ELISA测试中免疫识别了全毒液及其组分，并能够通过预孵育中和2 × LD50（半数致死剂量）的 M. ancoralis 毒液，估计效力至少为0.2 mg毒液/mL抗蛇毒血清。这一结果表明，由 M. ancoralis 引起的蛇咬伤可通过该抗蛇毒血清有效治疗。

**论文解读文章**

**研究背景、存在问题与研究意义**

美洲新大陆珊瑚蛇是眼镜蛇科（Elapidae）在美洲的唯一代表，分为Micruroides和Micrurus两个属，其中Micrurus属已识别超过90个物种。这些蛇类分布广泛，从美国南部至阿根廷均有记录。尽管Micrurus属引起的蛇咬伤事件仅占所有蛇咬伤的约3%，但其毒液中的神经毒性成分可导致严重的中毒症状，初始表现为双侧眼睑下垂，进而发展为弛缓性膈肌麻痹，最终引发呼吸衰竭甚至死亡。这些毒性效应主要由三指毒素（3FTxs）和IA型磷脂酶A2（PLA2s）介导。3FTxs通过阻断神经肌肉接头处乙酰胆碱（ACh）与其受体的结合发挥作用，而PLA2s则水解突触前膜上的甘油磷脂，导致ACh释放的不可逆抑制。

在哥伦比亚，已知分布有多个Micrurus物种，但其系统发育关系和毒液特征的研究仍不完整。锚珊瑚蛇Micrurus ancoralis因其颈部的锚状斑纹而得名，是南美三联组中的大型珊瑚蛇，体长可达150 cm，分布于巴拿马东南部至厄瓜多尔西南部安第斯山脉西坡，在哥伦比亚主要栖息于太平洋低地和西部科迪勒拉山脉西坡的多个省份。尽管该物种在其分布范围内相对常见，但此前其系统发育位置、毒液组成及毒理学效应从未被研究，也缺乏针对其咬伤后抗蛇毒血清有效性的评估。因此，开展这项研究旨在通过系统发育分析确定M. ancoralis在Micrurus属中的进化地位，通过蛋白质组学和功能表征揭示其毒液组成与毒性活性，并评估哥伦比亚国家卫生研究所（INS）生产的马抗珊瑚蛇毒血清对该毒液的免疫识别与中和能力。该研究对于理解珊瑚蛇毒液的多样性、指导临床抗蛇毒血清的选择具有重要意义。论文发表在《Tropical Medicine and Infectious Disease》。

**主要关键技术方法**

研究人员从哥伦比亚基布多-乔科省（Quibdó-Chocó）蛇类养殖场捕获的4只成年M. ancoralis个体（雌雄兼有）中手动采集毒液，混合后作为样本。采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）对毒液进行分离，获得28个色谱峰；随后通过SDS-PAGE电泳和基于质谱（nESI-MS/MS）的蛋白质组学策略（包括“毒液组学”和“鸟枪法蛋白质组学”）鉴定各蛋白家族，并利用色谱峰面积比计算相对丰度。使用合成底物4-NOBA测定PLA2活性，以偶氮酪蛋白水解评估蛋白水解活性，以L-亮氨酸底物测定L-氨基酸氧化酶（LAAO）活性，以BApNA底物测定酰胺水解活性。体内实验采用瑞士-韦伯斯特小鼠（18-20 g），通过腹腔注射测定半数致死剂量（LD₅₀），通过肌内注射测定肌毒性（血浆肌酸激酶水平），通过足垫注射测定水肿诱导活性。毒液RP-HPLC分离的7个最丰富组分也被筛选致死性，并测定致死组分的完整分子量。免疫识别采用酶联免疫吸附试验（ELISA），以INS抗珊瑚蛇毒血清（批号19AMP01）为抗体，检测其对全毒液及各色谱组分的结合能力。中和实验通过预孵育2×LD₅₀毒液与抗蛇毒血清（固定比例0.2 mg毒液/mL抗蛇毒血清）后腹腔注射小鼠，观察存活率。系统发育分析基于线粒体ND4基因片段（约700 bp），采用最大似然法（ML）和贝叶斯推断（BI）构建进化树，引用46个Micrurus物种序列及外群。

**研究结果**

**3.1. 色谱、电泳和蛋白质组学特征**
通过RP-HPLC分离M. ancoralis毒液，获得28个色谱峰（图2A）。SDS-PAGE显示低分子量蛋白（<15 kDa）主要存在于F3至F21组分（图2B）。蛋白质组学分析表明，毒液组成以磷脂酶A2（PLA2）为主，占蛋白总量的51.7%；其次为三指毒素（3FTxs），占23.2%。其他蛋白家族包括Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂（KUN，7.1%）、L-氨基酸氧化酶（LAAO，4.7%）、蛇毒金属蛋白酶（SVMP，3.7%）、ohanin（OHA，3.1%）、血管内皮生长因子（VEGF）及肽类/非蛋白物质（P/NP，1.9%）、C型凝集素样蛋白（CTL，1.4%）等。另有少量家族如谷胱甘肽过氧化物酶（GPOX）、透明质酸酶（HYA）、核苷酸酶（NUC）、蛇毒丝氨酸蛋白酶（SVSP）、磷酸二酯酶（PD）、核糖核酸酶（RBN）、翻译富集因子（TRF）、半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CysP）和血小板衍生生长因子（PDGF）仅以痕量存在（<0.1%），另有1.9%未鉴定。鸟枪法分析鉴定出9个蛋白家族：PLA2（10个蛋白）、3FTxs（5个）、OHA（2个）、神经生长因子（NGF，1个）、VEGF（1个）、SVMP（5个）、LAAO（4个）、HYA（1个）和SVSP（2个）。

**3.2. 蛇毒功能表征**
M. ancoralis毒液对小鼠的腹腔注射LD₅₀为45.2 μg/只（2.37 μg/g体重）。在实验条件下，毒液未检测到蛋白水解活性或酰胺水解活性。其PLA2活性（以4-NOBA为底物）低于M. dumerilii毒液，与M. mipartitus毒液相似（图4A）。水肿形成和肌毒性活性也呈现类似模式，M. dumerilii毒液活性最高（图4C、4D）。LAAO活性在三种毒液间相当（图4B）。

**3.3. 最丰富毒液组分的表征**
选取7个最丰富色谱组分（F5、F7、F11、F18、F19、F20、F21）进行小鼠腹腔注射致死性筛选，其中F7、F18和F20在50 μg/只剂量下显示致死活性（图2）。完整分子量分析显示：F7含有单同位素质量6844.32 Da和6863.31 Da，符合3FTxs特征，且无PLA2活性；F18具有PLA2活性，含分子量13,473.91 Da、13,490.90 Da、13,511.89 Da和13,547.58 Da的组分；F20同时具有PLA2活性、水肿诱导活性、肌毒性和致死活性（LD₅₀=45.6 μg/只），其分子量13,392.78 Da、13,411.79 Da、13,429.79 Da、13,454.73 Da和13,473.77 Da均与PLA2相符。

**3.4. 治疗性马抗珊瑚蛇毒血清（INS）对M. ancoralis毒液的免疫识别与中和**
ELISA滴定显示，INS抗蛇毒血清对M. ancoralis、M. dumerilii和M. mipartitus全毒液具有相似的免疫识别曲线（图5）。对RP-HPLC各组分的免疫识别分析表明，富含PLA2和KUN蛋白的组分信号最强，含3FTxs的组分识别程度中等至较低，含C型凝集素的组分识别水平最低（图6）。在预孵育实验中，INS抗蛇毒血清在0.2 mg毒液/mL抗蛇毒血清的比例下，可完全中和2×LD₅₀的M. ancoralis毒液，所有小鼠均存活。此外，对3只个体毒液的比较显示，色谱图谱定性保守但存在峰强度差异：标本2在3FTx对应的组分（F5、F7、F10、F11）丰度降低，PLA2活性最低，且其毒液被INS抗蛇毒血清的识别程度也较低（图7）。系统发育分析基于ND4基因，将M. ancoralis以强支持率（99/1.00）置于triadal/bicolor支系内，与M. narduccii呈姐妹群关系，且处于连接南美三联物种与二色支系（如M. mipartitus、M. camilae）的基部位置（图8）。

**讨论总结与结论翻译**

**讨论总结**：讨论部分指出，新世界珊瑚蛇源自中新世从旧世界通过北方陆桥的单次成功迁入事件，Micruroides属是Micrurus属的姐妹群。当前分子系统学支持将Micrurus分为monadal支系和triadal/bicolor支系，M. ancoralis基于ND4基因被置于triadal/bicolor支系基部，与M. narduccii呈姐妹关系，这与基于半阴茎解剖和色彩模式的传统形态学分类一致。从毒液组学角度看，M. ancoralis毒液以PLA2（51.7%）和3FTxs（23.2%）为主，与哥伦比亚其他多种Micrurus物种（如M. dumerilii、M. helleri、M. medemi、M. sangilensis、M. camilae）的PLA2优势型相似，但不同于M. mipartitus的3FTx优势型（61%）。毒液致死活性（LD₅₀ 45.2 μg/只）与M. camilae相近，但低于其他哥伦比亚物种。至少三个致死组分（F7为3FTx，F18和F20为PLA2）被鉴定，其中F20具有致死、肌毒和炎性活性。毒液还表现出中等的水肿诱导和肌毒性，而PLA2活性低于M. dumerilii。免疫学实验显示，INS抗蛇毒血清（免疫原不包括M. ancoralis）能有效识别M. ancoralis全毒液及组分，对PLA2组分的识别强于3FTx组分，这与3FTx低免疫原性的普遍观察一致。重要的是，该抗蛇毒血清在预孵育条件下完全中和了毒液的致死作用，效力至少为0.2 mg毒液/mL抗蛇毒血清，提示该抗蛇毒血清可用于治疗M. ancoralis咬伤。

**结论翻译**：本研究提供了M. ancoralis的首次系统发育分析及其毒液的蛋白质组学和功能表征，为哥伦比亚珊瑚蛇毒液的多样性和毒性活性提供了新的见解。M. ancoralis在系统发育上以强支持率位于triadal/bicolor支系内，占据连接南美三联物种与二色支系的基部位置。M. ancoralis毒液主要由PLA2酶组成，其次为3FTxs，该特征与多种其他Micrurus物种的PLA2优势型表型一致。在功能上，该毒液在小鼠中表现出中等致死效力，以及肌毒性和水肿诱导效应。在体外，该毒液缺乏可测量的蛋白水解活性和酰胺水解活性，但具有PLA2活性，该活性可能负责肌毒性和水肿形成。至少三个致死组分（包括PLA2和3FTx）的鉴定揭示了这些毒素家族对毒液毒性的贡献。特别是最丰富的组分F20，由PLA2同工型组成，可能在毒液的致死、肌毒和炎性病理效应中发挥作用。从免疫学角度看，INS抗珊瑚蛇毒血清显示出对M. ancoralis毒液的有效识别和中和能力。