《Aquaculture》：CsNatterin-3 serves as a pattern recognition molecule that activates the peripheral blood leukocytes of
Cynoglossus semilaevis against bacterial infection
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摘要Natterin-3是硬骨鱼中重要的免疫效应分子，参与抗菌防御。然而，其在先天免疫中的作用机制仍不明确。本研究从半滑舌鳎中分离出Natterin-3（CsNatterin-3），并研究其对抗哈维氏弧菌的功能。CsNatterin-3包含DM9结构域和类似气溶酶的孔形成结构域。
摘要
Natterin-3是硬骨鱼中重要的免疫效应分子，参与抗菌防御。然而，其在先天免疫中的作用机制仍不明确。本研究从半滑舌鳎中分离出Natterin-3（CsNatterin-3），并研究其对抗哈维氏弧菌的功能。CsNatterin-3包含DM9结构域和类似气溶酶的孔形成结构域。该蛋白在肝脏和黏膜组织中高表达，在细菌感染时表达显著上升。重组CsNatterin-3可通过识别脂多糖和肽聚糖与细菌广泛结合，进而诱导细菌聚集。细菌感染后，rCsNatterin-3能与外周血白细胞相互作用，增强细胞的吞噬作用、活性氧生成、酸磷酸酶活性以及促炎细胞因子和Toll样受体的表达。此外，rCsNatterin-3还能保护外周血白细胞免受毒性损伤，并促进细菌清除。体内实验表明，rCsNatterin-3可减轻组织损伤、降低细菌负荷并提高鱼类存活率；而敲低CsNatterin-3则会增加细菌定植并提高鱼类死亡率。这些发现表明，CsNatterin-3在病原体识别与细胞激活之间起桥梁作用，从而介导对细菌感染的免疫防御。
引言
半滑舌鳎是东北亚重要的经济养殖鱼类，具有较高的营养价值（Wei等，2021；Zhao等，2022）。然而，水产养殖业的快速发展也带来了多种细菌性疾病，造成了巨大的经济损失（Hao等，2023）。在各类细菌性疾病中，弧菌病是对半滑舌鳎可持续养殖构成的主要威胁（Zhou等，2022）。患病的鱼类会出现严重的病理症状，包括皮肤大面积溃疡（Zhang等，2020）、器官淤血（Li等，2024a）、败血症和肠炎（Liu等，2020）。
黏膜免疫系统是抵御病原体感染的第一道防线（Hopo等，2024）。在硬骨鱼中，皮肤、鳃和肠道等黏膜组织不仅起到物理屏障的作用，还会释放多种免疫效应分子来消灭入侵的病原体（Guardiola等，2019；Mokhtar等，2023）。在鱼类表皮的黏液层中含有多种免疫因子，如溶菌酶、补体蛋白、凝集素、免疫球蛋白、抗菌肽以及孔形成蛋白（Díaz-Puertas等，2023）。在病原体感染过程中，这些免疫因子会发生显著变化，从而保护宿主免受微生物侵害（Dawar等，2024）。其中，孔形成蛋白具有直接的杀菌活性和免疫调节功能（Chen等，2018）。在斑马鱼中，Aep1是一种类似气溶酶的蛋白质，可作为典型的孔形成蛋白发挥直接抗菌作用（Chen等，2018）。在硬骨鱼中，宿主防御肽通过孔形成机制选择性清除病原体，这类机制包括桶状孔模型和环状孔模型（Chen等，2019；Priyadarshini等，2022）。在大黄鱼的组织分泌物中，βγ-CAT复合物利用类似气溶酶的孔形成结构域在溶酶体膜上形成寡聚通道，进而引发IL-1β释放和炎性小体活化，从而促进细菌清除（Xiang等，2014）。
孔形成蛋白根据其特定结构呈现出不同的孔形成策略（Mondal和Chattopadhyay，2022）。太阳海星中的肌动蛋白孔形成蛋白由中央的β折叠结构及两侧的α螺旋组成，其N端的亲水α螺旋可识别鞘脂并插入细胞膜，形成桶状孔从而导致细胞裂解（Palacios-Ortega等，2021）。作为硬骨鱼的抗菌肽，鱼源防御肽可通过形成临时孔道或通道来破坏膜结构，从而发挥抗菌作用（Asensio-Calavia等，2023）。昆虫防御肽的N端疏水螺旋可插入细胞膜，而C端极性螺旋则参与免疫信号通路的调控（Shi等，2025）。在哺乳动物毒素中，穿孔素以类似胆固醇依赖性细胞裂素的机制在细菌中形成孔洞（Voskoboinik等，2015）。在炎症反应中，Gasdermin D可形成β桶状孔，从而引发焦亡作用（Ding等，2016）。防御素则通过β折叠结构破坏细菌膜完整性，在先天免疫中发挥广谱抗菌作用（Fu等，2023）。在大黄鱼中，类似气溶酶的蛋白BmALP1可与BmTFF3结合在细胞膜上形成孔洞，最终引发免疫激活（Bian等，2023）。这一过程受到抑制因子BmALP3的负向调控以及正向调控因子FCGBP的调控（Bian等，2023）。
DM9结构域最初在黑腹果蝇中被发现，后来在无脊椎动物和部分脊椎动物中也有分布（Ponting等，2001；Jiang等，2017）。在巨牡蛎中，CgDM9CP含有两个DM9结构域，可作为模式识别受体识别病原体相关分子模式（Liu等，2021；Li等，2025）。CgDM9CP-3参与血细胞的包裹和微生物的凝集作用（Liu等，2021），而CgDM9CP-8则是炎症信号传导的关键调控因子（Li等，2025）。在硬骨鱼和七鳃鳗中，DM9结构域常常与类似气溶酶的孔形成结构域共同存在（Sun等，2025）。
Natterin家族成员的结构具有高度保守性，通常包含N端的DM9结构域和C端的ALP结构域（Hatakeyama和Unno，2023）。在玫瑰海鞘中，SaroL-1通过β三叶形凝集素结构域识别糖类，同时利用ALP结构域发挥孔形成功能（Notova等，2022）。在多子菱鲉中，类似Natterin的蛋白是血浆和血淋巴中的主要蛋白质之一（Leprêtre等，2019）。在非毒鱼鳕鱼中，该蛋白在皮肤和免疫相关组织中高表达（Rajan等，2017）。在日本七鳃鳗中，Natterin家族成员与补体因子共同发挥针对病原体和肿瘤细胞的特异性细胞毒性作用（Wu等，2017）。在斑马鱼中，Natterins可通过IRF3/7-CFBR1通路诱导I型干扰素的表达，从而连接干扰素信号与炎性小体信号，协同激活Caspase2以发挥抗菌防御作用（Gusso等，2025）。
在Natterin家族成员中，Natterin-3的结构与Natterin-4极为相似，但与Natterin-1和Natterin-2存在明显差异（Lima等，2021）。Natterin-3拥有独特的保守序列特征，可用于将其与其他Natterin成员区分开来（Lima等，2021）。不过，硬骨鱼中的Natterin-3在病原体识别和抗菌免疫中的作用机制仍不清楚。本研究从半滑舌鳎中分离出了Natterin-3的同源蛋白（CsNatterin-3），并研究了其在哈维氏弧菌感染过程中的免疫功能。实验结果表明，CsNatterin-3具备识别和凝集细菌、调节免疫反应以及提高感染期间鱼类存活率的能力。
章节节选
实验动物
实验用的半滑舌鳎（20±1克）购自中国天津的海盛海鲜有限公司，饲养在20℃的含氧海水中。实验开始前，所有鱼只均通过平板计数法检测，确认未受到细菌感染（Wang等，2025）。用于制备多克隆抗体的雌性BALB/c小鼠购自中国北京的思培福生物技术有限公司。所有涉及活体动物的实验均获得了相应伦理委员会的批准。
CsNatterin-3被确认为Natterin的同源蛋白
CsNatterin-3由397个氨基酸残基组成，包含两个典型结构域：DM9结构域（22–217号残基）和ALP结构域（218–396号残基）（图1A和图S1A）。CELLO分析显示，CsNatterin-3是一种分泌蛋白，预测分子量为44.4 kDa，等电点为5.39。三维结构模型显示，CsNatterin-3中含有多个β折叠结构（图S1B）。序列比对结果显示，CsNatterin-3与其它Natterin蛋白的相似度在27.95%到83.29%之间。
讨论
Natterin家族具有高度保守的结构特征，已在众多脊椎动物中得到广泛研究（Lima等，2021）。这类蛋白通常包含N端的DUF3421结构域，该结构域含有DM9重复序列（Molina-Cruz等，2020），以及C端的类似气溶酶的β桶状孔形成结构模块（Lima等，2021）。从分类学分布来看，Natterin家族成员存在于多种硬骨鱼、七鳃鳗、爬行动物和鸟类中。
CRediT作者贡献说明
高培远：论文撰写——初稿撰写、验证、实验研究、数据整理。王璇月：可视化处理、实验研究、定量分析。江新毅：可视化处理、实验研究、定量分析。雅力坤·依帕尔古丽：实验研究。袁增志：论文撰写——审稿与编辑、概念设计。李墨菲：论文撰写——审稿与编辑、资源协调、资金申请、概念设计。
伦理声明
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南开展。
本研究已获得天津师范大学伦理委员会的批准。
（批准编号：2026070701）。
未引用参考文献
Charroux等，2018
Magalh?es等，2005
致谢
本研究得到了以下项目的资助：天津市社会发展与农业科技项目（编号：23YFZCSN00140）、国家自然科学基金（编号：42476094）、天津市自然科学基金项目（编号：23JCYBJC00240），以及天津市青年学者计划杰出教授项目。
高培远|王璇月|江新毅|雅力坤·依帕尔古丽|袁增志|李墨菲
中国天津市西青区滨水西路393号，天津师范大学生命科学学院，动物与植物抗逆性天津市重点实验室，邮编300387
